التصوير داخل الجسم لتعبير البروتين الفلوري في الفئران المصابة بإصابة دماغية رضحية مغلقة الجمجمة ونافذة الجمجمة باستخدام مجهر ثنائي الفوتون
Summary
توضح هذه الدراسة تسليم إصابة دماغية رضحية متكررة للفئران وزرع متزامن لنافذة الجمجمة للتصوير اللاحق داخل الجسم ل EGFP المعبر عنه بالخلايا العصبية باستخدام المجهر ثنائي الفوتون.
Abstract
الهدف من هذا البروتوكول هو توضيح كيفية التصور الطولي للتعبير عن وتوطين بروتين مهم داخل أنواع معينة من خلايا دماغ الحيوان ، عند التعرض للمنبهات الخارجية. هنا ، يتم عرض إدارة إصابة الدماغ الرضحية المغلقة في الجمجمة (TBI) والزرع المتزامن لنافذة الجمجمة للتصوير الطولي اللاحق داخل الجسم في الفئران. يتم حقن الفئران داخل الجمجمة بفيروس مرتبط بالغدي (AAV) يعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (EGFP) تحت محفز عصبي محدد. بعد 2 إلى 4 أسابيع ، تتعرض الفئران لإصابات الدماغ الرضية المتكررة باستخدام جهاز إنقاص الوزن فوق موقع حقن AAV. في نفس الجلسة الجراحية ، يتم زرع الفئران بعمود رأس معدني ثم نافذة زجاجية في الجمجمة فوق موقع تأثير إصابات الدماغ الرضية. يتم فحص التعبير والتوطين الخلوي ل EGFP باستخدام مجهر ثنائي الفوتون في نفس منطقة الدماغ المعرضة للصدمة على مدار أشهر.
Introduction
إصابات الدماغ الرضحية (TBI) ، والتي يمكن أن تنجم عن الإصابات الرياضية وتصادم المركبات والقتال العسكري ، هي مصدر قلق صحي في جميع أنحاء العالم. يمكن أن يؤدي TBI إلى عجز فسيولوجي ومعرفي وسلوكي ، وإعاقة أو وفيات مدى الحياة 1,2. يمكن تصنيف شدة إصابات الدماغ الرضية على أنها خفيفة ومتوسطة وشديدة ، والغالبية العظمى منها خفيفة إصابات الدماغ الرضية (75٪ -90٪)3. من المعترف به بشكل متزايد أن إصابات الدماغ الرضية ، وخاصة التكرار لإصابات الدماغ الرضية ، يمكن أن تعزز تنكس الخلايا العصبية وتعمل كعوامل خطر للعديد من الأمراض التنكسية العصبية ، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD) ، والتصلب الجانبي الضموري (ALS) ، والخرف الجبهي الصدغي (FTD) ، والاعتلال الدماغي الرضحي المزمن (CTE)4،5،6. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء التنكس العصبي الناجم عن إصابات الدماغ الرضية لا تزال غير واضحة ، وبالتالي تمثل مجالا نشطا للدراسة. للحصول على نظرة ثاقبة حول كيفية استجابة الخلايا العصبية والتعافي من إصابات الدماغ الرضية ، يتم وصف طريقة لمراقبة البروتينات ذات العلامات الفلورية ذات الأهمية ، وتحديدا داخل الخلايا العصبية ، عن طريق التصوير الطولي داخل الجسم في الفئران بعد إصابات الدماغ الرضية هنا.
تحقيقا لهذه الغاية ، توضح هذه الدراسة كيفية الجمع بين إجراء جراحي لإدارة إصابات الدماغ الرضية المغلقة في الجمجمة يشبه ما تم الإبلاغ عنه سابقا 7,8 ، جنبا إلى جنب مع إجراء جراحي لزرع نافذة الجمجمة للتصوير داخل المصب ، كما وصفه Goldey etal 9. والجدير بالذكر أنه ليس من الممكن زرع نافذة الجمجمة أولا ثم إجراء إصابات الدماغ الرضية في نفس المنطقة ، حيث من المحتمل أن يؤدي تأثير انخفاض الوزن الذي يحفز إصابات الدماغ الرضية إلى إتلاف النافذة والتسبب في ضرر لا يمكن إصلاحه للفأر. لذلك ، تم تصميم هذا البروتوكول لإدارة إصابات الدماغ الرضية ثم زرع نافذة الجمجمة مباشرة فوق موقع التأثير ، كل ذلك خلال نفس الجلسة الجراحية. تتمثل ميزة الجمع بين كل من إصابات الدماغ الرضية وزرع نافذة الجمجمة في جلسة جراحية واحدة في تقليل عدد المرات التي يخضع فيها الفأر لعملية جراحية. علاوة على ذلك ، فإنه يسمح للمرء بمراقبة الاستجابة الفورية (أي على مقياس زمني للساعات) لإصابات الدماغ الرضية ، بدلا من زرع النافذة في جلسة جراحية لاحقة (أي التصوير الأولي الذي يبدأ على مقياس زمني من الأيام بعد إصابات الدماغ الرضية). توفر نافذة الجمجمة ومنصة التصوير داخل الجسم أيضا مزايا على مراقبة البروتينات العصبية بالطرق التقليدية مثل التلوين المناعي للأنسجة الثابتة. على سبيل المثال ، هناك حاجة إلى عدد أقل من الفئران للتصوير داخل الجسم ، حيث يمكن دراسة نفس الفأر في نقاط زمنية متعددة ، على عكس مجموعات منفصلة من الفئران اللازمة لنقاط زمنية منفصلة. علاوة على ذلك ، يمكن مراقبة نفس الخلايا العصبية بمرور الوقت ، مما يسمح للمرء بتتبع أحداث بيولوجية أو مرضية محددة داخل نفس الخلية.
كدليل على المفهوم ، يتم توضيح التعبير الخاص بالخلايا العصبية لبروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (EGFP) تحت مروج المشبك هنا10. يمكن توسيع هذا النهج ليشمل 1) أنواع مختلفة من خلايا الدماغ من خلال استخدام محفزات أخرى محددة من نوع الخلية ، مثل مروج البروتين الأساسي للمايلين (MBP) للخلايا قليلة التغصن ومحفز البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) للخلايا النجمية11 ، 2) البروتينات المستهدفة المختلفة ذات الأهمية عن طريق دمج جيناتها مع جين EGFP ، و 3) المشاركة في التعبير عن بروتينات متعددة تنصهر في فلوروفورات مختلفة. هنا ، يتم تعبئة EGFP والتعبير عنه عن طريق توصيل الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) من خلال الحقن داخل الجمجمة. يتم إعطاء إصابات الدماغ الرضية المغلقة باستخدام جهاز إنقاص الوزن ، يليه زرع نافذة الجمجمة. يتم تحقيق تصور EGFP العصبي من خلال نافذة الجمجمة ، باستخدام المجهر ثنائي الفوتون للكشف عن مضان EGFP في الجسم الحي. باستخدام ليزر الفوتون الثنائي ، من الممكن اختراق الأنسجة القشرية بشكل أعمق مع الحد الأدنى من التلف الضوئي ، مما يسمح بالتصوير الطولي المتكرر لنفس المناطق القشرية داخل فأر فردي لأيام وحتىأشهر 12،13،14،15. باختصار ، يهدف هذا النهج المتمثل في الجمع بين جراحة TBI والتصوير داخل الجسم إلى تعزيز فهم الأحداث الجزيئية التي تساهم في أمراض الأمراض التي يسببها TBI16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة ، تم الجمع بين حقن AAV ، وإدارة TBI ، وعمود الرأس مع زرع نافذة الجمجمة لتحليل التصوير الطولي للخلايا العصبية التي تحمل علامة EGFP داخل قشرة دماغ الفأر (الطبقات الرابعة والخامسة) لمراقبة آثار TBI على الخلايا العصبية القشرية. تشير هذه الدراسة إلى أن موقع TBI المختار هنا ، فوق الحصين ، ي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور ميغيل سينا إستيفيس من كلية الطب بجامعة ماساتشوستس تشان لإهدائه فيروس AAV (PHP.eB) -Syn1-EGFP ، وديبرا كاميرون في كلية الطب بجامعة ماساتشوستس تشان لرسم رسم جمجمة الفئران. كما نشكر الأعضاء الحاليين والسابقين في مختبرات Bosco و Schafer و Henninger على اقتراحاتهم ودعمهم. تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة الدفاع (W81XWH202071 / PRARP) إلى DAB و DS و NH.
Materials
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
| BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
| Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
| Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
| Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
| Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
| Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
| Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
| Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
| Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
| Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
| Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
| Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
| Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
| Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
| Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
| Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
| Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
| Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
| Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
| Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
| Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
| Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
| Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
| Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
| Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
| surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
| Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
| Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
| Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |
References
- Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).
- National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. . Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , (2022).
- Xu, X., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).
- Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
- Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).
- McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).
- Henninger, N., et al. Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1. Brain. 139, 1094-1105 (2016).
- Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Kugler, S., et al. Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors. Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).
- von Jonquieres, G., et al. Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice. Biomaterials. 276, 121060 (2021).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Mondo, E., et al. A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature. The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).
- White, M. A., et al. TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD. Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).
- Chou, A., et al. Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).
- Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice. Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).
- Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
- Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
- Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Li, D., et al. A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice. eLight. 2 (1), 1-18 (2022).
- Paveliev, M., et al. Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).
- Han, X., et al. In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).
- Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report. Medicine. 99 (32), 21601 (2020).
- Courville, C. B. The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations. Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).
- Drew, L. B., Drew, W. E. The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury. Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).
