Intravitale beeldvorming van fluorescerende eiwitexpressie bij muizen met een gesloten schedel traumatisch hersenletsel en schedelvenster met behulp van een microscoop met twee fotonen

Traumatisch hersenletsel (TBI), dat het gevolg kan zijn van sportblessures, botsingen met voertuigen en militaire gevechten, is een wereldwijd gezondheidsprobleem. TBI kan leiden tot fysiologische, cognitieve en gedragsstoornissen en levenslange invaliditeit of mortaliteit ^1,2. De ernst van TBI kan worden geclassificeerd als mild, matig en ernstig, waarbij de overgrote meerderheid milde TBI is (75%-90%)³. Het wordt steeds meer erkend dat TBI, met name herhaalde voorvallen van TBI, neuronale degeneratie kan bevorderen en als risicofactoren kan dienen voor verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer (AD), amyotrofische laterale sclerose (ALS), frontotemporale dementie (FTD) en chronische traumatische encefalopathie (CTE)^4,5,6. De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan TBI-geïnduceerde neurodegeneratie blijven echter onduidelijk en vormen dus een actief studiegebied. Om inzicht te krijgen in hoe neuronen reageren op en herstellen van TBI, wordt hierin een methode beschreven voor het monitoren van fluorescerend gelabelde eiwitten die van belang zijn, met name in neuronen, door middel van longitudinale intravitale beeldvorming bij muizen na TBI.

Daartoe laat deze studie zien hoe een chirurgische ingreep voor de toediening van gesloten schedel-TBI die vergelijkbaar is met wat eerder is gerapporteerd^7,8 kan worden gecombineerd met een chirurgische ingreep voor implantatie van een schedelvenster voor stroomafwaartse intravitale beeldvorming^, zoals beschreven door Goldey et al⁹. Het is met name niet haalbaar om eerst een schedelraam te implanteren en vervolgens een TBI in dezelfde regio uit te voeren, omdat de impact van de gewichtsval die de TBI induceert het venster waarschijnlijk zal beschadigen en onherstelbare schade aan de muis zal toebrengen. Daarom is dit protocol ontworpen om de TBI toe te dienen en vervolgens het schedelvenster direct boven de impactplaats te implanteren, allemaal binnen dezelfde chirurgische sessie. Een voordeel van het combineren van zowel de TBI als de schedelvensterimplantatie in één operatiesessie is een vermindering van het aantal keren dat een muis wordt geopereerd. Verder stelt het iemand in staat om de onmiddellijke respons (d.w.z. op de tijdschaal van uren) op TBI te volgen, in tegenstelling tot het implanteren van het venster bij een latere chirurgische sessie (d.w.z. de eerste beeldvorming die begint op een tijdschaal van dagen na TBI). Het craniale venster en het intravitale beeldvormingsplatform bieden ook voordelen ten opzichte van het monitoren van neuronale eiwitten met conventionele methoden, zoals immunokleuring van vaste weefsels. Er zijn bijvoorbeeld minder muizen nodig voor intravitale beeldvorming, omdat dezelfde muis op meerdere tijdstippen kan worden bestudeerd, in tegenstelling tot afzonderlijke cohorten muizen die nodig zijn voor discrete tijdstippen. Verder kunnen dezelfde neuronen in de loop van de tijd worden gevolgd, waardoor men specifieke biologische of pathologische gebeurtenissen binnen dezelfde cel kan volgen.

Als proof of concept wordt hier de neuronspecifieke expressie van versterkt groen fluorescerend eiwit (EGFP) onder de synapsinepromotor gedemonstreerd¹⁰. Deze benadering kan worden uitgebreid tot 1) verschillende hersenceltypen door gebruik te maken van andere celtypespecifieke promotors, zoals myeline-basisproteïne (MBP)-promotor voor oligodendrocyten en glia-fibrillair zuur eiwit (GFAP)-promotor voor astrocyten¹¹, 2) verschillende doeleiwitten van belang door hun genen te fuseren met het EGFP-gen, en 3) meerdere eiwitten tot co-expressie te brengen die zijn gefuseerd met verschillende fluoroforen. Hier wordt EGFP verpakt en tot expressie gebracht via adeno-geassocieerd virus (AAV) toediening via een intracraniële injectie. Een TBI met gesloten schedel wordt toegediend met behulp van een apparaat voor gewichtsval, gevolgd door implantatie van een schedelvenster. Visualisatie van neuronale EGFP wordt bereikt door het craniale venster, met behulp van twee-fotonmicroscopie om EGFP-fluorescentie in vivo te detecteren. Met de twee-fotonlaser is het mogelijk om dieper in het corticale weefsel door te dringen met minimale fotoschade, waardoor herhaalde longitudinale beeldvorming van dezelfde corticale regio’s binnen een individuele muis gedurende dagen en tot maanden mogelijk is^12,13,14,15. Kortom, deze benadering van het combineren van een TBI-operatie met intravitale beeldvorming heeft tot doel het begrip van de moleculaire gebeurtenissen die bijdragen aan TBI-geïnduceerde ziektepathologie te vergroten^16,17.