Прижизненная визуализация экспрессии флуоресцентных белков у мышей с закрытой черепно-мозговой травмой и краниальным окном с использованием двухфотонного микроскопа

Черепно-мозговая травма (ЧМТ), которая может возникнуть в результате спортивных травм, столкновений транспортных средств и военных действий, является проблемой здравоохранения во всем мире. ЧМТ может привести к физиологическим, когнитивным и поведенческим нарушениям, а также к пожизненной инвалидности или смертности ^1,2. Тяжесть ЧМТ можно классифицировать как легкую, умеренную и тяжелую, в подавляющем большинстве случаев это легкая ЧМТ (75%-90%)³. Все чаще признается, что ЧМТ, особенно повторяющиеся случаи ЧМТ, могут способствовать дегенерации нейронов и служить факторами риска развития ряда нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера (БА), боковой амиотрофический склероз (БАС), лобно-височную деменцию (ЛВД) и хроническую травматическую энцефалопатию (ХТЭ)^4,5,6. Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе нейродегенерации, вызванной ЧМТ, остаются неясными и, таким образом, представляют собой активную область исследований. Чтобы получить представление о том, как нейроны реагируют на ЧМТ и восстанавливаются после нее, в данной статье описан метод мониторинга флуоресцентно меченых белков, представляющих интерес, особенно внутри нейронов, с помощью продольной прижизненной визуализации у мышей после ЧМТ.

С этой целью в данном исследовании показано, как сочетать хирургическую процедуру для введения закрытой черепно-мозговой ЧМТ, аналогичную той, о которой сообщалось ранее^7,8, с хирургической процедурой имплантации краниального окна для последующей прижизненной визуализации^, как описано Goldey et al⁹. Примечательно, что невозможно сначала имплантировать краниальное окно, а затем выполнить ЧМТ в той же области, так как воздействие падения веса, которое вызывает ЧМТ, может повредить окно и нанести непоправимый вред мыши. Таким образом, этот протокол был разработан для проведения ЧМТ, а затем имплантации краниального окна непосредственно над местом удара, и все это в рамках одного хирургического сеанса. Преимуществом сочетания ЧМТ и имплантации краниального окна в одном хирургическом сеансе является сокращение количества операций, которые мышь подвергается хирургическому вмешательству. Кроме того, это позволяет отслеживать немедленный ответ (т.е. в течение нескольких часов) на ЧМТ, в отличие от имплантации окна на более позднем хирургическом сеансе (т.е. первичная визуализация, начинающаяся в течение нескольких дней после ЧМТ). Краниальное окно и платформа прижизненной визуализации также имеют преимущества по сравнению с мониторингом белков нейронов традиционными методами, такими как иммуноокрашивание фиксированных тканей. Например, для прижизненной визуализации требуется меньшее количество мышей, так как одна и та же мышь может быть изучена в несколько временных точек, в отличие от отдельных когорт мышей, необходимых для дискретных моментов времени. Кроме того, одни и те же нейроны могут контролироваться с течением времени, что позволяет отслеживать конкретные биологические или патологические события в одной и той же клетке.

В качестве доказательства концепции здесь демонстрируется нейрон-специфическая экспрессия усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) под промотором синапсина¹⁰. Этот подход может быть распространен на: 1) различные типы клеток головного мозга путем использования других специфических промоторов клеточного типа, таких как промотор основного белка миелина (MBP) для олигодендроцитов и промотор глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) для астроцитов¹¹, 2) различные белки-мишени, представляющие интерес, путем слияния их генов с геном EGFP, и 3) коэкспрессия нескольких белков, объединенных с различными флуорофорами. Здесь EGFP упаковывается и экспрессируется путем доставки аденоассоциированного вируса (AAV) через внутричерепную инъекцию. ЧМТ с закрытым черепом проводится с помощью устройства для снижения веса с последующей имплантацией краниального окна. Визуализация нейронального EGFP достигается через краниальное окно с помощью двухфотонной микроскопии для обнаружения флуоресценции EGFP in vivo. С помощью двухфотонного лазера можно проникнуть глубже в кортикальную ткань с минимальным фотоповреждением, что позволяет проводить повторную продольную визуализацию одних и тех же областей коры у отдельной мыши в течение нескольких дней и месяцев^12,13,14,15. Таким образом, этот подход, сочетающий операцию ЧМТ с прижизненной визуализацией, направлен на углубление понимания молекулярных событий, которые способствуют патологии, вызванной ЧМТ^16,17.