Imaging intravitale dell'espressione di proteine fluorescenti nei topi con una lesione cerebrale traumatica a cranio chiuso e una finestra cranica utilizzando un microscopio a due fotoni

La lesione cerebrale traumatica (TBI), che può derivare da lesioni sportive, collisioni di veicoli e combattimenti militari, è un problema di salute in tutto il mondo. Il trauma cranico può portare a deficit fisiologici, cognitivi e comportamentali e disabilità o mortalità permanente ^1,2. La gravità del trauma cranico può essere classificata come lieve, moderata e grave, la stragrande maggioranza dei quali è un trauma cranico lieve (75%-90%)³. È sempre più riconosciuto che il trauma cranico, in particolare le occorrenze ripetitive di trauma cranico, possono promuovere la degenerazione neuronale e fungere da fattori di rischio per diverse malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer (AD), la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), la demenza frontotemporale (FTD) e l’encefalopatia traumatica cronica (CTE)^4,5,6. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base della neurodegenerazione indotta da TBI rimangono poco chiari e rappresentano quindi un’area di studio attiva. Per ottenere informazioni su come i neuroni rispondono e si riprendono dal trauma cranico, viene descritto un metodo per il monitoraggio delle proteine di interesse marcate con fluorescenza, in particolare all’interno dei neuroni, mediante imaging intravitale longitudinale nei topi dopo trauma cranico.

A tal fine, questo studio mostra come combinare una procedura chirurgica per la somministrazione di un trauma cranico a cranio chiuso simile a quella precedentemente riportata^7,8, insieme a una procedura chirurgica per l’impianto di una finestra cranica per l’imaging intravitale a valle^, come descritto da Goldey et al⁹. In particolare, non è possibile impiantare prima una finestra cranica e successivamente eseguire un trauma cranico nella stessa regione, poiché l’impatto della caduta di peso che induce il trauma cranico rischia di danneggiare la finestra e causare danni irreparabili al topo. Pertanto, questo protocollo è stato progettato per somministrare il trauma cranico e quindi impiantare la finestra cranica direttamente sul sito di impatto, il tutto all’interno della stessa sessione chirurgica. Un vantaggio della combinazione del trauma cranico e dell’impianto della finestra cranica in un’unica sessione chirurgica è la riduzione del numero di volte in cui un topo viene sottoposto a intervento chirurgico. Inoltre, consente di monitorare la risposta immediata (cioè sulla scala temporale di ore) al trauma cranico, invece di impiantare la finestra in una sessione chirurgica successiva (cioè l’imaging iniziale che inizia su una scala temporale di giorni dopo il trauma cranico). La finestra cranica e la piattaforma di imaging intravitale offrono anche vantaggi rispetto al monitoraggio delle proteine neuronali con metodi convenzionali come l’immunocolorazione dei tessuti fissi. Ad esempio, sono necessari meno topi per l’imaging intravitale, poiché lo stesso topo può essere studiato in più punti temporali, al contrario di coorti separate di topi necessarie per punti temporali discreti. Inoltre, gli stessi neuroni possono essere monitorati nel tempo, consentendo di tracciare specifici eventi biologici o patologici all’interno della stessa cellula.

Come prova di concetto, l’espressione neurone-specifica della proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) sotto il promotore della sinapsina è dimostrata qui¹⁰. Questo approccio può essere esteso a 1) diversi tipi di cellule cerebrali utilizzando altri promotori specifici del tipo di cellula, come il promotore della proteina basica della mielina (MBP) per gli oligodendrociti e il promotore della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) per gli astrociti¹¹, 2) diverse proteine bersaglio di interesse fondendo i loro geni con il gene EGFP e 3) co-esprimendo più proteine fuse a diversi fluorofori. In questo caso, l’EGFP viene confezionato ed espresso tramite la somministrazione di virus adeno-associati (AAV) attraverso un’iniezione intracranica. Un trauma cranico a cranio chiuso viene somministrato utilizzando un dispositivo per la riduzione del peso, seguito dall’impianto di una finestra cranica. La visualizzazione dell’EGFP neuronale si ottiene attraverso la finestra cranica, utilizzando la microscopia a due fotoni per rilevare la fluorescenza dell’EGFP in vivo. Con il laser a due fotoni, è possibile penetrare più in profondità nel tessuto corticale con un fotodanno minimo, consentendo l’imaging longitudinale ripetuto delle stesse regioni corticali all’interno di un singolo topo per giorni e fino a mesi^12,13,14,15. In sintesi, questo approccio di combinazione di un intervento chirurgico per trauma cranico con l’imaging intravitale mira a far progredire la comprensione degli eventi molecolari che contribuiscono alla patologia della malattia indotta da trauma cranico^16,17.