Intravitale Bildgebung der fluoreszierenden Proteinexpression bei Mäusen mit Schädel-Hirn-Trauma und Schädelfenster mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop

Schädel-Hirn-Traumata (SHT), die durch Sportverletzungen, Fahrzeugkollisionen und militärische Kämpfe entstehen können, sind ein weltweites Gesundheitsproblem. SHT kann zu physiologischen, kognitiven und Verhaltensdefiziten sowie zu lebenslanger Behinderung oder Mortalität führen ^1,2. Der Schweregrad des Schädel-Hirn-Traumas kann als leicht, mittelschwer und schwer klassifiziert werden, wobei die überwiegende Mehrheit ein leichtes SHT ist (75 %-90 %)³. Es wird zunehmend anerkannt, dass SHT, insbesondere das wiederholte Auftreten von SHT, die neuronale Degeneration fördern und als Risikofaktoren für verschiedene neurodegenerative Erkrankungen dienen kann, darunter Alzheimer (AD), amyotrophe Lateralsklerose (ALS), frontotemporale Demenz (FTD) und chronische traumatische Enzephalopathie (CTE)^4,5,6. Die molekularen Mechanismen, die der SHT-induzierten Neurodegeneration zugrunde liegen, sind jedoch noch unklar und stellen daher ein aktives Forschungsgebiet dar. Um einen Einblick in die Art und Weise zu gewinnen, wie Neuronen auf SHT reagieren und sich davon erholen, wird hierin ein Verfahren zur Überwachung fluoreszenzmarkierter Proteine von Interesse, insbesondere innerhalb von Neuronen, durch longitudinale intravitale Bildgebung bei Mäusen nach einem SHT beschrieben.

Zu diesem Zweck wird in dieser Studie gezeigt, wie ein chirurgisches Verfahren zur Verabreichung eines Schädel-Hirn-SHT kombiniert werden kann, das dem ähnelt, was zuvor berichtet wurde^7,8, zusammen mit einem chirurgischen Verfahren zur Implantation eines kranialen Fensters für die nachgeschaltete intravitale Bildgebung^, wie von Goldey et al.^{beschrieben 9}. Insbesondere ist es nicht möglich, zuerst ein Schädelfenster zu implantieren und anschließend ein Schädel-Hirn-Trauma in derselben Region durchzuführen, da der Aufprall des Gewichtsverlusts, der das Schädel-Hirn-Trauma auslöst, wahrscheinlich das Fenster beschädigt und der Maus irreparable Schäden zufügt. Daher wurde dieses Protokoll entwickelt, um das SHT zu verabreichen und dann das Schädelfenster direkt über der Aufprallstelle zu implantieren, und das alles innerhalb derselben chirurgischen Sitzung. Ein Vorteil der Kombination von SHT und Schädelfensterimplantation in einer einzigen chirurgischen Sitzung ist die Verringerung der Anzahl der Operationen, mit denen eine Maus operiert wird. Darüber hinaus ermöglicht es die unmittelbare Reaktion (d. h. auf der Zeitskala von Stunden) auf ein SHT, im Gegensatz zur Implantation des Fensters bei einer späteren chirurgischen Sitzung (d. h. die erste Bildgebung beginnt auf einer Zeitskala von Tagen nach dem SHT). Das kraniale Fenster und die intravitale Bildgebungsplattform bieten auch Vorteile gegenüber der Überwachung neuronaler Proteine mit herkömmlichen Methoden wie der Immunfärbung von fixiertem Gewebe. Zum Beispiel werden weniger Mäuse für die intravitale Bildgebung benötigt, da dieselbe Maus zu mehreren Zeitpunkten untersucht werden kann, im Gegensatz zu separaten Kohorten von Mäusen, die für diskrete Zeitpunkte benötigt werden. Darüber hinaus können dieselben Neuronen im Laufe der Zeit überwacht werden, so dass bestimmte biologische oder pathologische Ereignisse innerhalb derselben Zelle verfolgt werden können.

Als Proof of Concept wird hier die neuronenspezifische Expression des verstärkten grün fluoreszierenden Proteins (EGFP) unter dem Synapsin-Promotor demonstriert¹⁰. Dieser Ansatz kann auf 1) verschiedene Gehirnzelltypen ausgeweitet werden, indem andere zelltypspezifische Promotoren verwendet werden, wie z. B. Myelin-Basisprotein (MBP)-Promotor für Oligodendrozyten und Gliafibrillen-Säureprotein (GFAP)-Promotor für Astrozyten¹¹, 2) verschiedene Zielproteine von Interesse, indem ihre Gene mit dem EGFP-Gen fusioniert werden, und 3) mehrere Proteine co-exprimieren, die mit verschiedenen Fluorophoren fusioniert sind. Hier wird EGFP verpackt und über das Adeno-assoziierte Virus (AAV) durch eine intrakranielle Injektion exprimiert. Ein Schädel-Hirn-Trauma wird mit einem Gewichtsabfallgerät verabreicht, gefolgt von der Implantation eines Schädelfensters. Die Visualisierung der neuronalen EGFP erfolgt durch das kraniale Fenster, wobei die Zwei-Photonen-Mikroskopie verwendet wird, um die EGFP-Fluoreszenz in vivo zu detektieren. Mit dem Zwei-Photonen-Laser ist es möglich, mit minimaler Photoschädigung tiefer in das kortikale Gewebe einzudringen, was eine wiederholte Längsbildgebung derselben kortikalen Regionen innerhalb einer einzelnen Maus über Tage und bis zu Monate ermöglicht^12,13,14,15. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser Ansatz, eine SHT-Operation mit intravitaler Bildgebung zu kombinieren, darauf abzielt, das Verständnis der molekularen Ereignisse zu verbessern, die zur SHT-induzierten Krankheitspathologie beitragen^16,17.