Ein dreifaches primäres Zellkulturmodell der menschlichen Blut-Hirn-Schranke zur Untersuchung des ischämischen Schlaganfalls in vitro

Schlaganfall ist weltweit eine der häufigsten Todes- und Langzeitinvaliditätsursachen¹. Die Inzidenz von Schlaganfällen nimmt mit zunehmendem Alter schnell zu und verdoppelt sich alle 10 Jahre nach dem 55. Lebensjahr². Der ischämische Schlaganfall tritt als Folge einer Störung des zerebralen Blutflusses aufgrund thrombotischer und embolischer Ereignisse auf, was mehr als 80% aller Schlaganfallfälle ausmacht³. Schon jetzt gibt es relativ wenige Behandlungsmöglichkeiten, um den Gewebetod nach einem ischämischen Schlaganfall zu minimieren. Die Behandlungen, die es gibt, sind zeitkritisch und führen folglich nicht immer zu guten klinischen Ergebnissen. Daher ist die Erforschung komplexer zellulärer Mechanismen des ischämischen Schlaganfalls, die die Erholung nach einem Schlaganfall beeinflussen, dringend erforderlich.

Die BHS ist eine dynamische Schnittstelle für den Austausch von Molekülen zwischen dem Blut und dem Hirnparenchym. Strukturell besteht die BBB aus mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns, die durch Verbindungskomplexe verbunden sind, die von einer Basalmembran, Perizyten und astrozytären Endfüßen umgeben sind⁴. Perizyten und Astrozyten spielen eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der BBB-Integrität durch die Sekretion verschiedener Faktoren, die für die Bildung starker Tight Junctions notwendig sind ^5,6. Der Zusammenbruch der BBB ist eines der Kennzeichen des ischämischen Schlaganfalls. Akute Entzündungsreaktionen und oxidativer Stress im Zusammenhang mit zerebraler Ischämie führen zur Störung von Tight-Junction-Proteinkomplexen und zu einem gestörten Crosstalk zwischen Astrozyten, Perizyten und Endothelzellen, was zu einer erhöhten parazellulären gelösten Permeabilität über die BBB⁷ führt. Die BBB-Dysfunktion fördert die Bildung von Hirnödemen weiter und erhöht das Risiko einer hämorrhagischen Transformation⁸. Unter Berücksichtigung all dessen besteht ein großes Interesse daran, die molekularen und zellulären Veränderungen zu verstehen, die auf BBB-Ebene während und nach einem ischämischen Schlaganfall auftreten.

Obwohl viele In-vitro-BBB-Modelle in den letzten Jahrzehnten entwickelt und in einer Vielzahl von Studien verwendet wurden, kann keines von ihnen In-vivo-Bedingungen vollständig replizieren⁹. Während einige Modelle auf Endothelzellmonoschichten basieren, die auf gut einsetzenden permeablen Trägern allein oder in Kombination mit Perizyten oder Astrozyten kultiviert wurden, haben erst neuere Studien Triple-Zellkultur-Modelldesigns eingeführt. Fast alle existierenden Dreifachkultur-BBB-Modelle enthalten primäre Hirnendothelzellen zusammen mit Astrozyten und Perizyten, die aus Tierarten oder Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen isoliert wurden^10,11,12,13.

In Anerkennung der Notwendigkeit, die menschliche BHS in vitro besser zu rekapitulieren, haben wir ein Dreifachzellkultur-In-vitro-BBB-Modell etabliert, das aus mikrovaskulären Endothelzellen des menschlichen Gehirns (HBMEC), primären menschlichen Astrozyten (HA) und primären vaskulären Perizyten des menschlichen Gehirns (HBVP) besteht. Dieses Dreifachkultur-BBB-Modell ist auf 6-Well-Platten-Polyestermembraneinsätzen mit einer Porengröße von 0,4 μm aufgebaut. Diese Well-Inserts bieten eine optimale Umgebung für die Zellanheftung und ermöglichen einen einfachen Zugang zu apikalen (Blut) und basolateralen (Gehirn) Kompartimenten für die Medienprobenahme oder die Anwendung von Verbindungen. Die Merkmale dieses vorgeschlagenen Dreifachzellkultur-BBB-Modells werden durch Messung von TEER und parazellulärem Fluss nach OGD bewertet, der den ischämischen Schlaganfall in vitro nachahmt, wobei ein Mangel an Sauerstoff (<1% O₂) und Nährstoffen (unter Verwendung eines glukosefreien Mediums) durch die Verwendung einer befeuchteten, versiegelten Kammer erreicht wird. Zusätzlich werden induzierte ischämische Zustände in diesem Modell durch direkte Visualisierung hypoxischer Zellen genau verifiziert.