מודל תלת-תאי ראשוני של מחסום הדם-מוח האנושי לחקר שבץ איסכמי במבחנה
Summary
במאמר זה נתאר את השיטה לביסוס מודל של תרבית תאים משולשת של מחסום הדם-מוח המבוסס על תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במוח האנושי, אסטרוציטים ופריציטים. מודל רב-תאי זה מתאים למחקרים על תפקוד לקוי של יחידות נוירו-וסקולריות במהלך שבץ איסכמי במבחנה או לסינון מועמדים לתרופות.
Abstract
שבץ איסכמי הוא גורם מרכזי למוות ולנכות ברחבי העולם עם אפשרויות טיפוליות מוגבלות. הנוירופתולוגיה של שבץ איסכמי מאופיינת על ידי הפרעה באספקת הדם למוח המובילה למוות תאי ותפקוד קוגניטיבי. במהלך ואחרי שבץ איסכמי, תפקוד לקוי של מחסום דם-מוח (BBB) מקל על התקדמות הפציעה ותורם להחלמה לקויה של המטופל. המודלים הנוכחיים של BBB כוללים בעיקר מונוקולטורות אנדותל ותרביות כפולות עם אסטרוציטים או פריציטים.
מודלים כאלה חסרים את היכולת לחקות באופן מלא מיקרו-סביבה מוחית דינמית, החיונית לתקשורת בין תאים. בנוסף, מודלים נפוצים של BBB מכילים לעתים קרובות תאי אנדותל אנושיים מונצחים או תרביות תאים שמקורן בבעלי חיים (מכרסם, חזיר או בקר) המציבות מגבלות תרגום. מאמר זה מתאר מודל BBB חדשני המבוסס על הכנסה טובה המכיל רק תאים אנושיים ראשוניים (תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח, אסטרוציטים ופריסיטים של כלי דם במוח) המאפשרים לחקור פגיעה מוחית איסכמית במבחנה.
ההשפעות של מחסור בחמצן-גלוקוז (OGD) על שלמות המחסום הוערכו על ידי חדירות פסיבית, מדידות התנגדות חשמלית טרנסאנדותליאלית (TEER) והדמיה ישירה של תאים היפוקסיים. הפרוטוקול המוצג מציע יתרון מובהק בחיקוי הסביבה הבין-תאית של ה-BBB in vivo, ומשמש כמודל BBB מציאותי יותר במבחנה לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות במסגרת פגיעה מוחית איסכמית.
Introduction
שבץ מוחי הוא אחד הגורמים המובילים למוות ולנכות ארוכת טווח ברחבי העולם1. שכיחות השבץ עולה במהירות עם הגיל, ומכפילה את עצמה כל 10 שנים לאחר גיל 552. שבץ איסכמי מתרחש כתוצאה מהפרעה בזרימת הדם במוח עקב אירועים טרומבוטיים ותסחיפיים, המקיפים יותר מ -80% מכלל מקרי השבץ3. גם כיום, קיימות אפשרויות טיפול מעטות יחסית למזעור מוות של רקמות בעקבות שבץ איסכמי. הטיפולים שכן קיימים הם תלויי זמן וכתוצאה מכך לא תמיד מובילים לתוצאות קליניות טובות. לכן, מחקר על מנגנונים תאיים מורכבים של שבץ איסכמי המשפיעים על התאוששות לאחר שבץ הוא נחוץ בדחיפות.
ה-BBB הוא ממשק דינמי להחלפת מולקולות בין הדם לפרנכימה של המוח. מבחינה מבנית, ה-BBB מורכב מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח המחוברים ביניהם על ידי קומפלקסים צומתיים המוקפים בקרום מרתף, פריציטים ואנדפיטים אסטרוציטיים4. פריסיטים ואסטרוציטים ממלאים תפקיד חיוני בשמירה על שלמות BBB באמצעות הפרשת גורמים שונים הדרושים להיווצרות צמתים חזקים והדוקים 5,6. התמוטטות ה- BBB היא אחד מסימני ההיכר של שבץ איסכמי. תגובה דלקתית חריפה ועקה חמצונית הקשורה לאיסכמיה מוחית גורמת לשיבוש של קומפלקסים של חלבונים בצמתים הדוקים ולהצלבה לא מווסתת בין אסטרוציטים, פריציטים ותאי אנדותל, מה שמוביל לחדירות מוגברת של מומסים פרא-תאיים ברחבי BBB7. תפקוד לקוי של BBB מקדם עוד יותר את היווצרות בצקת המוח ומגביר את הסיכון לטרנספורמציה דימומית8. בהתחשב בכל האמור לעיל, יש עניין רב בהבנת השינויים המולקולריים והתאיים המתרחשים ברמת BBB במהלך ואחרי שבץ איסכמי.
למרות שמודלים רבים של BBB במבחנה פותחו בעשורים האחרונים ומשמשים במגוון מחקרים, אף אחד מהם לא יכול לשכפל באופן מלא בתנאי in vivo 9. בעוד שחלק מהמודלים מבוססים על מונולרים של תאי אנדותל שגודלו בתרבית על תמיכות חדירות היטב לבדן או בשילוב עם פריסיטים או אסטרוציטים, רק מחקרים עדכניים יותר הציגו עיצובים של מודלים של תרביות תאים משולשות. כמעט כל המודלים הקיימים של BBB בתרבית משולשת משלבים תאי אנדותל ראשוניים במוח יחד עם אסטרוציטים ופריסיטים שבודדו ממיני בעלי חיים או תאים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים10,11,12,13.
מתוך הכרה בצורך לשחזר טוב יותר את ה-BBB במבחנה האנושית, הקמנו תרבית תאים משולשת במבחנה מודל BBB המורכב מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח האנושי (HBMEC), אסטרוציטים אנושיים ראשוניים (HA) ופריסיטים וסקולריים ראשוניים במוח האנושי (HBVP). דגם BBB תלת-תרבותי זה ממוקם על צלחת 6 בארות, תוספות קרום פוליאסטר בגודל נקבוביות של 0.4 מיקרומטר. תוספות טובות אלה מספקות סביבה אופטימלית לחיבור תאים ומאפשרות גישה נוחה הן לתאים אפיקליים (דם) והן לתאים בזולטרליים (מוח) לדגימה בינונית או ליישום מורכב. התכונות של מודל BBB מוצע זה של תרבית תאים משולשת מוערכות על ידי מדידת TEER ושטף על-תאי לאחר OGD המחקה שבץ איסכמי במבחנה, עם מחסור בחמצן (<1% O2) וחומרים מזינים (על ידי שימוש במדיום נטול גלוקוז) המושג באמצעות תא לח ואטום. בנוסף, תנאים דמויי איסכמיה המושרים במודל זה מאומתים במדויק על ידי הדמיה ישירה של תאים היפוקסיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה להקמת מודל BBB אמין של תרבית תאי אנדותל-פריציטים-אסטרוציטים לחקר תפקוד לקוי של BBB בהגדרה של שבץ איסכמי במבחנה. בהתחשב בכך pericytes הם השכנים הקרובים ביותר של תאי אנדותל in vivo, HBVP מצופים על החלק התחתון של מוסיף היטב מודלזה 16. למרות שתצורה זו חסרה ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 ו- DA047157.
Materials
| 24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3450 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Life Sciences (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
| Astrocyte Medium | Science Cell | 1801 | |
| Attachment Factor | Cell Systems (Fisher Scientific) | 4Z0-201 | |
| BD 60 mL Syringe | BD | 309653 | |
| BrainPhys Imaging Optimized Medium | STEMCELL Technologies | 5791 | |
| Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost | 4Z0-500 | Cell Systems | |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap | VWR | 430829 | |
| Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask | Corning | 431464U | |
| Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3340 | |
| Countes Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
| Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution | Fisher Scientific | 04-355-71 | |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) | ThermoFisher | A14430-01 | Glucose-free medium |
| DPBS (No Calcium, No Magnesium) | ThermoFisher | 14190250 | |
| EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL | Lonza | CC-3129 | |
| EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes | World Precison Instruments | NC9792051 | Epithelial voltohmmeter |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
| Fluorview FV3000 Confocal Microscope | Olympus | FV3000 | |
| Gas Tank (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
| HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) | Thermofisher | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | |
| Human Astrocytes | Science Cell | 1800 | |
| Human Brain Vascular Pericytes | Science Cell | 1200 | |
| Hypoxia Incubator Chamber | STEMCELL Technologies | 27310 | |
| Image-iT Green Hypoxia Reagent | ThermoFisher | I14834 | |
| Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
| Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ACBRI 376 | Cell Systems | |
| Rocking Platform Shaker, Double | VWR | 10860-658 | |
| Single Flow Meter | STEMCELL Technologies | 27311 | |
| SpectraMax iD3 Microplate Reader | Molecular Devices | 75886-128 | |
| Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile | NEST Scientific | 380121 | |
| TPP Mutli-well Plates (6 wells) | MidSci | TP92406 | |
| TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks | MidSci | TP90075 | Flasks with activated surface for cell adhesion |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
| Uno Stage Top Incubator- | Oko Lab | UNO-T-H-CO2-TTL |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 133 (94), 38 (2016).
- Yousufuddin, M., Young, N. Aging and ischemic stroke. Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).
- Donkor, E. S. Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life. Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).
- Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).
- Brown, L. S., et al. Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).
- Cabezas, R., et al. Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson’s disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).
- Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).
- Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities. Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).
- He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).
- Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes. PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).
- Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types. ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).
- Xu, L., et al. Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model. International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).
- Appelt-Menzel, A. Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).
- Zhang, Y., et al. Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo. Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).
- Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
- Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).
- Lyck, R., et al. ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).
- Rizzi, E., et al. A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
- Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma. Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).
- Stone, N. L., England, T. J., O’Sullivan, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).
- Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).
