Un modèle de culture cellulaire primaire triple de la barrière hémato-encéphalique humaine pour l’étude de l’AVC ischémique in vitro
Summary
Ici, nous décrivons la méthode pour établir un modèle de culture triple cellulaire de la barrière hémato-encéphalique basé sur les cellules endothéliales microvasculaires primaires du cerveau humain, les astrocytes et les péricytes. Ce modèle multicellulaire est adapté aux études de dysfonctionnement de l’unité neurovasculaire lors d’un AVC ischémique in vitro ou au criblage de candidats médicaments.
Abstract
L’AVC ischémique est une cause majeure de décès et d’invalidité dans le monde entier avec des options thérapeutiques limitées. La neuropathologie de l’AVC ischémique se caractérise par une interruption de l’apport sanguin au cerveau entraînant la mort cellulaire et un dysfonctionnement cognitif. Pendant et après un AVC ischémique, le dysfonctionnement de la barrière hémato-encéphalique (BHE) facilite la progression des blessures et contribue à une mauvaise récupération du patient. Les modèles actuels de BHE comprennent principalement des monocultures endothéliales et des co-cultures doubles avec des astrocytes ou des péricytes.
De tels modèles n’ont pas la capacité d’imiter pleinement un microenvironnement cérébral dynamique, ce qui est essentiel pour la communication de cellule à cellule. De plus, les modèles de BHE couramment utilisés contiennent souvent des cellules endothéliales humaines immortalisées ou des cultures cellulaires d’origine animale (rongeurs, porcins ou bovins) qui posent des limites translationnelles. Cet article décrit un nouveau modèle de BHE bien inséré contenant uniquement des cellules humaines primaires (cellules endothéliales microvasculaires cérébrales, astrocytes et péricytes vasculaires cérébraux) permettant d’étudier les lésions cérébrales ischémiques in vitro.
Les effets de la privation d’oxygène-glucose (OGD) sur l’intégrité de la barrière ont été évalués par perméabilité passive, mesures de résistance électrique transendothéliale (TEER) et visualisation directe des cellules hypoxiques. Le protocole présenté offre un avantage distinct en imitant l’environnement intercellulaire de la BHE in vivo, servant de modèle de BHE in vitro plus réaliste pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre d’une lésion cérébrale ischémique.
Introduction
L’AVC est l’une des principales causes de décès et d’invalidité de longue durée dans le monde1. L’incidence des accidents vasculaires cérébraux augmente rapidement avec l’âge, doublant tous les 10 ans après l’âge de 55 ans2. L’AVC ischémique survient à la suite d’une perturbation du flux sanguin cérébral due à des événements thrombotiques et emboliques, qui englobe plus de 80% de tous les cas d’AVC3. Même maintenant, il existe relativement peu d’options de traitement disponibles pour minimiser la mort tissulaire après un AVC ischémique. Les traitements existants sont sensibles au facteur temps et, par conséquent, ne conduisent pas toujours à de bons résultats cliniques. Par conséquent, il est urgent de mener des recherches sur les mécanismes cellulaires complexes de l’AVC ischémique qui affectent la récupération après un AVC.
La BHE est une interface dynamique pour l’échange de molécules entre le sang et le parenchyme cérébral. Structurellement, la BHE est composée de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales interconnectées par des complexes jonctionnels entourés d’une membrane basale, de péricytes et d’extrémités astrocytaires4. Les péricytes et les astrocytes jouent un rôle essentiel dans le maintien de l’intégrité de la BHE par la sécrétion de divers facteurs nécessaires à la formation de jonctions fortes et serrées 5,6. La dégradation de la BHE est l’une des caractéristiques de l’AVC ischémique. La réponse inflammatoire aiguë et le stress oxydatif associés à l’ischémie cérébrale entraînent la perturbation des complexes protéiques de jonction serrée et une diaphonie dérégulée entre les astrocytes, les péricytes et les cellules endothéliales, ce qui entraîne une augmentation de la perméabilité du soluté paracellulaire à travers la BHE7. Le dysfonctionnement de la BHE favorise davantage la formation d’œdème cérébral et augmente le risque de transformation hémorragique8. Compte tenu de tout ce qui précède, il y a un grand intérêt à comprendre les changements moléculaires et cellulaires qui se produisent au niveau de la BHE pendant et après un AVC ischémique.
Bien que de nombreux modèles de BHE in vitro aient été développés au cours des dernières décennies et utilisés dans diverses études, aucun d’entre eux ne peut reproduire pleinement les conditions in vivo 9. Alors que certains modèles sont basés sur des monocouches de cellules endothéliales cultivées sur des supports perméables bien insérés seuls ou en combinaison avec des péricytes ou des astrocytes, seules des études plus récentes ont introduit des modèles de culture triple cellulaire. Presque tous les modèles de BHE à triple culture existants incorporent des cellules endothéliales cérébrales primaires ainsi que des astrocytes et des péricytes isolés d’espèces animales ou des cellules dérivées de cellules souches pluripotentes humaines10,11,12,13.
Reconnaissant la nécessité de mieux récapituler la BHE humaine in vitro, nous avons établi un modèle de culture de cellules triples in vitro composé de cellules endothéliales microvasculaires du cerveau humain (HBMEC), d’astrocytes humains primaires (HA) et de péricytes vasculaires cérébraux humains primaires (HBVP). Ce modèle BBB à triple culture est installé sur des plaquettes à 6 puits, des inserts de membrane en polyester avec une taille de pores de 0,4 μm. Ces inserts de puits fournissent un environnement optimal pour la fixation des cellules et permettent un accès facile aux compartiments apical (sang) et basolatéral (cerveau) pour un échantillonnage moyen ou une application composée. Les caractéristiques de ce modèle de triple culture de cellules BBB proposé sont évaluées en mesurant le TEER et le flux paracellulaire post-OGD imitant l’AVC ischémique in vitro, avec une pénurie d’oxygène (<1% O2) et de nutriments (en utilisant un milieu sans glucose) obtenue en utilisant une chambre humidifiée et scellée. De plus, les conditions induites de type ischémique dans ce modèle sont vérifiées avec précision par visualisation directe des cellules hypoxiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour mettre en place un modèle fiable de culture BBB à triple cellule endothéliale-péricyte-astrocyte pour étudier le dysfonctionnement de la BHE dans le cadre d’un AVC ischémique in vitro. Considérant que les péricytes sont les plus proches voisins des cellules endothéliales in vivo, les HBVP sont plaqués sur la face inférieure des inserts de puits dans ce modèle16. Bien que cette configuration n’ait pas la communic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 et DA047157 des National Institutes of Health (NIH).
Materials
| 24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3450 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Life Sciences (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
| Astrocyte Medium | Science Cell | 1801 | |
| Attachment Factor | Cell Systems (Fisher Scientific) | 4Z0-201 | |
| BD 60 mL Syringe | BD | 309653 | |
| BrainPhys Imaging Optimized Medium | STEMCELL Technologies | 5791 | |
| Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost | 4Z0-500 | Cell Systems | |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap | VWR | 430829 | |
| Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask | Corning | 431464U | |
| Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3340 | |
| Countes Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
| Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution | Fisher Scientific | 04-355-71 | |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) | ThermoFisher | A14430-01 | Glucose-free medium |
| DPBS (No Calcium, No Magnesium) | ThermoFisher | 14190250 | |
| EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL | Lonza | CC-3129 | |
| EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes | World Precison Instruments | NC9792051 | Epithelial voltohmmeter |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
| Fluorview FV3000 Confocal Microscope | Olympus | FV3000 | |
| Gas Tank (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
| HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) | Thermofisher | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | |
| Human Astrocytes | Science Cell | 1800 | |
| Human Brain Vascular Pericytes | Science Cell | 1200 | |
| Hypoxia Incubator Chamber | STEMCELL Technologies | 27310 | |
| Image-iT Green Hypoxia Reagent | ThermoFisher | I14834 | |
| Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
| Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ACBRI 376 | Cell Systems | |
| Rocking Platform Shaker, Double | VWR | 10860-658 | |
| Single Flow Meter | STEMCELL Technologies | 27311 | |
| SpectraMax iD3 Microplate Reader | Molecular Devices | 75886-128 | |
| Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile | NEST Scientific | 380121 | |
| TPP Mutli-well Plates (6 wells) | MidSci | TP92406 | |
| TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks | MidSci | TP90075 | Flasks with activated surface for cell adhesion |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
| Uno Stage Top Incubator- | Oko Lab | UNO-T-H-CO2-TTL |
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