نموذج زراعة الخلايا الأولية الثلاثية للحاجز الدموي الدماغي البشري لدراسة السكتة الدماغية الإقفارية في المختبر
Summary
هنا ، نصف طريقة إنشاء نموذج زراعة الخلايا الثلاثية للحاجز الدموي الدماغي بناء على الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الأولية للدماغ البشري ، والخلايا النجمية ، والخلايا المحيطة. هذا النموذج متعدد الخلايا مناسب لدراسات الخلل الوظيفي لوحدة الأوعية الدموية العصبية أثناء السكتة الدماغية الإقفارية في المختبر أو لفحص الأدوية المرشحة.
Abstract
السكتة الدماغية الإقفارية هي سبب رئيسي للوفاة والعجز في جميع أنحاء العالم مع خيارات علاجية محدودة. يتميز علم الأمراض العصبية للسكتة الدماغية بانقطاع في تدفق الدم إلى الدماغ مما يؤدي إلى موت الخلايا والخلل المعرفي. أثناء وبعد السكتة الدماغية الإقفارية ، يسهل الخلل الوظيفي للحاجز الدموي الدماغي (BBB) تطور الإصابة ويساهم في ضعف تعافي المريض. تشمل نماذج BBB الحالية في المقام الأول الزراعات الأحادية البطانية والثقافات المشتركة المزدوجة مع الخلايا النجمية أو pericytes.
تفتقر هذه النماذج إلى القدرة على التقليد الكامل لبيئة الدماغ الدقيقة الديناميكية ، وهو أمر ضروري للتواصل من خلية إلى خلية. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تحتوي نماذج BBB شائعة الاستخدام على خلايا بطانية بشرية خالدة أو مزارع خلايا مشتقة من الحيوانات (القوارض أو الخنازير أو الأبقار) التي تشكل قيودا متعدية. تصف هذه الورقة نموذج BBB الجديد القائم على الإدراج الجيد والذي يحتوي فقط على الخلايا البشرية الأولية (الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الدماغ ، والخلايا النجمية ، والخلايا المحيطة بالأوعية الدموية في الدماغ) مما يتيح التحقيق في إصابة الدماغ الإقفارية في المختبر.
تم تقييم آثار الحرمان من الأكسجين والجلوكوز (OGD) على سلامة الحاجز من خلال النفاذية السلبية ، وقياسات المقاومة الكهربائية عبر البطانية (TEER) ، والتصور المباشر للخلايا التي تعاني من نقص الأكسجين. يقدم البروتوكول المقدم ميزة واضحة تحاكي البيئة بين الخلايا ل BBB في الجسم الحي ، حيث يعمل كنموذج BBB أكثر واقعية في المختبر لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة في وضع إصابة الدماغ الإقفارية.
Introduction
السكتة الدماغية هي واحدة من الأسباب الرئيسية للوفاة والعجز على المدى الطويل في جميع أنحاء العالم1. يزداد معدل الإصابة بالسكتة الدماغية بسرعة مع تقدم العمر ، حيث يتضاعف كل 10 سنوات بعد سن 552. تحدث السكتة الدماغية الإقفارية نتيجة لاضطراب تدفق الدم الدماغي بسبب الأحداث الخثارية والصمية ، والتي تشمل أكثر من 80 ٪ من جميع حالات السكتة الدماغية3. حتى الآن ، هناك عدد قليل نسبيا من خيارات العلاج المتاحة لتقليل موت الأنسجة بعد السكتة الدماغية. العلاجات الموجودة حساسة للوقت وبالتالي لا تؤدي دائما إلى نتائج سريرية جيدة. لذلك ، هناك حاجة ماسة للبحث عن الآليات الخلوية المعقدة للسكتة الدماغية التي تؤثر على التعافي بعد السكتة الدماغية.
BBB هي واجهة ديناميكية لتبادل الجزيئات بين الدم وحمة الدماغ. من الناحية الهيكلية ، يتكون BBB من خلايا بطانة الأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ مترابطة بواسطة مجمعات متقاطعة محاطة بغشاء قاعدي ، وخلايا محيطية ، وأقدام نجمية4. تلعب الخلايا النجمية والخلايا النجمية دورا أساسيا في الحفاظ على سلامة BBB من خلال إفراز العوامل المختلفة اللازمة لتشكيل تقاطعات قوية وضيقة 5,6. انهيار BBB هو واحد من السمات المميزة للسكتة الدماغية. تؤدي الاستجابة الالتهابية الحادة والإجهاد التأكسدي المرتبط بنقص التروية الدماغية إلى تعطيل مجمعات بروتين الوصلات الضيقة والحديث المتبادل غير المنظم بين الخلايا النجمية والخلايا المحيطة والخلايا البطانية ، مما يؤدي إلى زيادة نفاذية المذاب عبر BBB7. يعزز ضعف BBB تكوين وذمة الدماغ ويزيد من خطر التحول النزفي8. بالنظر إلى كل ما سبق ، هناك اهتمام كبير بفهم التغيرات الجزيئية والخلوية التي تحدث على مستوى BBB أثناء وبعد السكتة الدماغية.
على الرغم من أن العديد من نماذج BBB في المختبر قد تم تطويرها على مدى العقود الأخيرة واستخدامها في مجموعة متنوعة من الدراسات ، إلا أنه لا يمكن لأي منها التكرار الكامل في ظروف الجسم الحي 9. في حين أن بعض النماذج تعتمد على أحاديات الخلايا البطانية المستزرعة على دعامات نفاذة جيدة الإدخال بمفردها أو بالاشتراك مع pericytes أو الخلايا النجمية ، إلا أن الدراسات الحديثة فقط هي التي أدخلت تصميمات نماذج زراعة الخلايا الثلاثية. تتضمن جميع نماذج BBB الثلاثية الموجودة تقريبا خلايا بطانة الدماغ الأولية جنبا إلى جنب مع الخلايا النجمية والخلايا المحيطة المعزولة من الأنواع الحيوانية أو الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات10،11،12،13.
إدراكا للحاجة إلى تلخيص BBB البشري بشكل أفضل في المختبر ، أنشأنا نموذج BBB لثقافة الخلايا الثلاثية في المختبر يتكون من الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الدماغ البشري (HBMEC) ، والخلايا النجمية البشرية الأولية (HA) ، والخلايا الوعائية الأولية للدماغ البشري (HBVP). تم إعداد نموذج BBB الثلاثي هذا على 6 آبار ، وإدراج غشاء بوليستر بحجم مسام 0.4 ميكرومتر. توفر هذه الحشوات الجيدة بيئة مثالية لربط الخلايا وتتيح سهولة الوصول إلى كل من المقصورات القمية (الدموية) والقاعدية (الدماغية) لأخذ العينات المتوسطة أو التطبيق المركب. يتم تقييم ميزات نموذج BBB المقترح لثقافة الخلايا الثلاثية عن طريق قياس TEER والتدفق شبه الخلوي بعد OGD الذي يحاكي السكتة الدماغية الإقفارية في المختبر ، مع نقص الأكسجين (<1٪ O2) والمواد المغذية (باستخدام وسط خال من الجلوكوز) يتم تحقيقه باستخدام غرفة رطبة ومغلقة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التحقق بدقة من الحالات الشبيهة بنقص التروية المستحثة في هذا النموذج عن طريق التصور المباشر لخلايا نقص الأكسجين.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول ، وصفنا طريقة لإعداد نموذج BBB موثوق به لثقافة الخلايا البطانية الثلاثية – pericyte – النجمية لدراسة خلل BBB في وضع السكتة الدماغية الإقفارية في المختبر. بالنظر إلى أن pericytes هي أقرب جيران الخلايا البطانية في الجسم الحي ، فإن HBVP مطلي على الجانب السفلي من إدخالات البئر في …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) MH128022 و MH122235 و MH072567 و MH122235 و HL126559 و DA044579 و DA039576 و DA040537 و DA050528 و DA047157.
Materials
| 24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3450 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Life Sciences (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
| Astrocyte Medium | Science Cell | 1801 | |
| Attachment Factor | Cell Systems (Fisher Scientific) | 4Z0-201 | |
| BD 60 mL Syringe | BD | 309653 | |
| BrainPhys Imaging Optimized Medium | STEMCELL Technologies | 5791 | |
| Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost | 4Z0-500 | Cell Systems | |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap | VWR | 430829 | |
| Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask | Corning | 431464U | |
| Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3340 | |
| Countes Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
| Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution | Fisher Scientific | 04-355-71 | |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) | ThermoFisher | A14430-01 | Glucose-free medium |
| DPBS (No Calcium, No Magnesium) | ThermoFisher | 14190250 | |
| EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL | Lonza | CC-3129 | |
| EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes | World Precison Instruments | NC9792051 | Epithelial voltohmmeter |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
| Fluorview FV3000 Confocal Microscope | Olympus | FV3000 | |
| Gas Tank (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
| HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) | Thermofisher | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | |
| Human Astrocytes | Science Cell | 1800 | |
| Human Brain Vascular Pericytes | Science Cell | 1200 | |
| Hypoxia Incubator Chamber | STEMCELL Technologies | 27310 | |
| Image-iT Green Hypoxia Reagent | ThermoFisher | I14834 | |
| Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
| Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ACBRI 376 | Cell Systems | |
| Rocking Platform Shaker, Double | VWR | 10860-658 | |
| Single Flow Meter | STEMCELL Technologies | 27311 | |
| SpectraMax iD3 Microplate Reader | Molecular Devices | 75886-128 | |
| Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile | NEST Scientific | 380121 | |
| TPP Mutli-well Plates (6 wells) | MidSci | TP92406 | |
| TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks | MidSci | TP90075 | Flasks with activated surface for cell adhesion |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
| Uno Stage Top Incubator- | Oko Lab | UNO-T-H-CO2-TTL |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 133 (94), 38 (2016).
- Yousufuddin, M., Young, N. Aging and ischemic stroke. Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).
- Donkor, E. S. Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life. Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).
- Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).
- Brown, L. S., et al. Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).
- Cabezas, R., et al. Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson’s disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).
- Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).
- Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities. Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).
- He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).
- Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes. PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).
- Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types. ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).
- Xu, L., et al. Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model. International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).
- Appelt-Menzel, A. Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).
- Zhang, Y., et al. Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo. Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).
- Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
- Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).
- Lyck, R., et al. ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).
- Rizzi, E., et al. A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
- Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma. Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).
- Stone, N. L., England, T. J., O’Sullivan, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).
- Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).
