Een drievoudig primair celkweekmodel van de menselijke bloed-hersenbarrière voor het bestuderen van ischemische beroerte in vitro
Summary
Hier beschrijven we de methode voor het vaststellen van een drievoudig celkweekmodel van de bloed-hersenbarrière op basis van primaire microvasculaire endotheelcellen, astrocyten en pericyten van de menselijke hersenen. Dit meercellige model is geschikt voor studies van neurovasculaire eenheidsdisfunctie tijdens ischemische beroerte in vitro of voor de screening van kandidaat-geneesmiddelen.
Abstract
Ischemische beroerte is wereldwijd een belangrijke oorzaak van overlijden en invaliditeit met beperkte therapeutische opties. De neuropathologie van ischemische beroerte wordt gekenmerkt door een onderbreking van de bloedtoevoer naar de hersenen, wat leidt tot celdood en cognitieve disfunctie. Tijdens en na ischemische beroerte vergemakkelijkt bloed-hersenbarrière (BBB) disfunctie de progressie van letsel en draagt bij aan slecht herstel van de patiënt. Huidige BBB-modellen omvatten voornamelijk endotheelmonoculturen en dubbele coculturen met astrocyten of pericyten.
Dergelijke modellen missen het vermogen om een dynamische micro-omgeving van de hersenen volledig te imiteren, wat essentieel is voor cel-tot-cel communicatie. Bovendien bevatten veelgebruikte BBB-modellen vaak vereeuwigde menselijke endotheelcellen of van dieren afgeleide (knaagdier-, varkens- of runderen) celculturen die translationele beperkingen vormen. Dit artikel beschrijft een nieuw goed ingebracht BBB-model dat alleen primaire menselijke cellen bevat (hersenmicrovasculaire endotheelcellen, astrocyten en vasculaire pericyten in de hersenen) die het onderzoek van ischemisch hersenletsel in vitro mogelijk maakt.
De effecten van zuurstof-glucosedeprivatie (OGD) op de integriteit van de barrière werden beoordeeld door passieve permeabiliteit, transendotheliale elektrische weerstand (TEER) metingen en directe visualisatie van hypoxische cellen. Het gepresenteerde protocol biedt een duidelijk voordeel bij het nabootsen van de intercellulaire omgeving van de BBB in vivo, en dient als een realistischer in vitro BBB-model voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën in de setting van ischemisch hersenletsel.
Introduction
Beroerte is wereldwijd een van de belangrijkste doodsoorzaken en langdurige invaliditeit1. De incidentie van beroerte neemt snel toe met de leeftijd en verdubbelt elke 10 jaar na de leeftijd van 552. Ischemische beroerte treedt op als gevolg van verstoring van de cerebrale bloedstroom als gevolg van trombotische en embolische gebeurtenissen, die meer dan 80% van alle gevallen van beroerte omvat3. Zelfs nu zijn er relatief weinig behandelingsopties beschikbaar om weefseldood na ischemische beroerte te minimaliseren. De behandelingen die er wel zijn, zijn tijdgevoelig en leiden bijgevolg niet altijd tot goede klinische resultaten. Daarom is onderzoek naar complexe cellulaire mechanismen van ischemische beroerte die het herstel na een beroerte beïnvloeden dringend nodig.
De BBB is een dynamische interface voor de uitwisseling van moleculen tussen het bloed en het hersenparenchym. Structureel bestaat de BBB uit microvasculaire endotheelcellen van de hersenen die onderling verbonden zijn door junctionele complexen omgeven door een keldermembraan, pericyten en astrocytische endfeet4. Pericyten en astrocyten spelen een essentiële rol bij het behoud van de integriteit van BBB door de afscheiding van verschillende factoren die nodig zijn voor de vorming van sterke, tight junctions 5,6. De afbraak van de BBB is een van de kenmerken van ischemische beroerte. Acute ontstekingsreactie en oxidatieve stress geassocieerd met cerebrale ischemie resulteert in de verstoring van tight junction eiwitcomplexen en ontregelde overspraak tussen astrocyten, pericyten en endotheelcellen, wat leidt tot verhoogde paracellulaire opgeloste permeabiliteit over de BBB7. BBB-disfunctie bevordert verder de vorming van hersenoedeem en verhoogt het risico op hemorragische transformatie8. Gezien al het bovenstaande is er grote interesse in het begrijpen van de moleculaire en cellulaire veranderingen die optreden op BBB-niveau tijdens en na ischemische beroerte.
Hoewel veel in vitro BBB-modellen de afgelopen decennia zijn ontwikkeld en in verschillende onderzoeken zijn gebruikt, kan geen van hen in vivo omstandigheden volledig repliceren9. Hoewel sommige modellen gebaseerd zijn op endotheelcelmonolagen gekweekt op goed ingebrachte permeabele steunen alleen of in combinatie met pericyten of astrocyten, hebben alleen recentere studies drievoudige celkweekmodelontwerpen geïntroduceerd. Bijna alle bestaande BBB-modellen met drievoudige cultuur bevatten primaire hersen endotheelcellen samen met astrocyten en pericyten geïsoleerd uit diersoorten of cellen afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen 10,11,12,13.
Erkennend de noodzaak om de menselijke BBB in vitro beter samen te vatten, hebben we een drievoudig celkweek in vitro BBB-model opgezet dat bestaat uit microvasculaire endotheelcellen (HBMEC), primaire menselijke astrocyten (HA) en primaire vasculaire pericyten van de menselijke hersenen (HBVP). Dit BBB-model met drie kweken is opgesteld op 6-wells plaat, polyester membraaninzetstukken met een poriegrootte van 0,4 μm. Deze putinzetstukken bieden een optimale omgeving voor celaanhechting en bieden gemakkelijke toegang tot zowel apicale (bloed) als basolaterale (hersenen) compartimenten voor mediumbemonstering of samengestelde toepassing. De kenmerken van dit voorgestelde BBB-model met drievoudige celcultuur worden beoordeeld door teer en paracellulaire flux na OGD te meten die ischemische beroerte in vitro nabootst, met een tekort aan zuurstof (<1% O2) en voedingsstoffen (met behulp van glucosevrij medium) bereikt door een bevochtigde, afgesloten kamer te gebruiken. Bovendien worden geïnduceerde ischemische-achtige aandoeningen in dit model nauwkeurig geverifieerd door directe visualisatie van hypoxische cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol beschrijven we een methode om een betrouwbaar drievoudig endotheelcel-pericyten-astrocytenkweek BBB-model op te zetten voor het bestuderen van BBB-disfunctie in de setting van ischemische beroerte in vitro. Gezien het feit dat pericyten in vivo de dichtstbijzijnde buren van endotheelcellen zijn, zijn HBVP in dit model16 aan de onderkant van de putinzetstukken geplaatst. Hoewel deze configuratie de directe cel-naar-cel communicatie tussen astrocyten en endotheelcel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 en DA047157.
Materials
| 24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3450 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Life Sciences (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
| Astrocyte Medium | Science Cell | 1801 | |
| Attachment Factor | Cell Systems (Fisher Scientific) | 4Z0-201 | |
| BD 60 mL Syringe | BD | 309653 | |
| BrainPhys Imaging Optimized Medium | STEMCELL Technologies | 5791 | |
| Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost | 4Z0-500 | Cell Systems | |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap | VWR | 430829 | |
| Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask | Corning | 431464U | |
| Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3340 | |
| Countes Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
| Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution | Fisher Scientific | 04-355-71 | |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) | ThermoFisher | A14430-01 | Glucose-free medium |
| DPBS (No Calcium, No Magnesium) | ThermoFisher | 14190250 | |
| EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL | Lonza | CC-3129 | |
| EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes | World Precison Instruments | NC9792051 | Epithelial voltohmmeter |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
| Fluorview FV3000 Confocal Microscope | Olympus | FV3000 | |
| Gas Tank (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
| HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) | Thermofisher | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | |
| Human Astrocytes | Science Cell | 1800 | |
| Human Brain Vascular Pericytes | Science Cell | 1200 | |
| Hypoxia Incubator Chamber | STEMCELL Technologies | 27310 | |
| Image-iT Green Hypoxia Reagent | ThermoFisher | I14834 | |
| Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
| Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ACBRI 376 | Cell Systems | |
| Rocking Platform Shaker, Double | VWR | 10860-658 | |
| Single Flow Meter | STEMCELL Technologies | 27311 | |
| SpectraMax iD3 Microplate Reader | Molecular Devices | 75886-128 | |
| Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile | NEST Scientific | 380121 | |
| TPP Mutli-well Plates (6 wells) | MidSci | TP92406 | |
| TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks | MidSci | TP90075 | Flasks with activated surface for cell adhesion |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
| Uno Stage Top Incubator- | Oko Lab | UNO-T-H-CO2-TTL |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 133 (94), 38 (2016).
- Yousufuddin, M., Young, N. Aging and ischemic stroke. Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).
- Donkor, E. S. Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life. Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).
- Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).
- Brown, L. S., et al. Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).
- Cabezas, R., et al. Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson’s disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).
- Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).
- Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities. Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).
- He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).
- Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes. PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).
- Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types. ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).
- Xu, L., et al. Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model. International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).
- Appelt-Menzel, A. Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).
- Zhang, Y., et al. Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo. Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).
- Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
- Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).
- Lyck, R., et al. ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).
- Rizzi, E., et al. A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
- Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma. Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).
- Stone, N. L., England, T. J., O’Sullivan, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).
- Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).
