Здесь описан метод создания модели тройной клеточной культуры гематоэнцефалического барьера на основе первичных микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга человека, астроцитов и перицитов. Эта многоклеточная модель подходит для исследований дисфункции нервно-сосудистых единиц во время ишемического инсульта in vitro или для скрининга кандидатов на лекарства.
Ишемический инсульт является основной причиной смерти и инвалидности во всем мире с ограниченными терапевтическими возможностями. Невропатология ишемического инсульта характеризуется прерыванием кровоснабжения головного мозга, приводящим к гибели клеток и когнитивной дисфункции. Во время и после ишемического инсульта дисфункция гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) способствует прогрессированию травмы и способствует плохому восстановлению пациента. Современные модели ГЭБ в основном включают эндотелиальные монокультуры и двойные кокультуры с астроцитами или перицитами.
Таким моделям не хватает способности полностью имитировать динамическую микросреду мозга, которая необходима для межклеточной коммуникации. Кроме того, обычно используемые модели ГЭБ часто содержат увековеченные эндотелиальные клетки человека или клеточные культуры животного происхождения (грызуны, свиньи или крупного рогатого скота), которые создают трансляционные ограничения. В этой статье описывается новая модель ГЭБ, содержащая только первичные клетки человека (микрососудистые эндотелиальные клетки мозга, астроциты и перициты сосудов головного мозга), позволяющая исследовать ишемическую черепно-мозговую травму in vitro.
Влияние кислородно-глюкозной депривации (OGD) на целостность барьера оценивали с помощью измерений пассивной проницаемости, трансэндотелиального электрического сопротивления (TEER) и прямой визуализации гипоксических клеток. Представленный протокол предлагает явное преимущество в проникновении межклеточной среды ГЭБ in vivo, служа более реалистичной моделью BBB in vitro для разработки новых терапевтических стратегий в условиях ишемической черепно-мозговой травмы.
Инсульт является одной из ведущих причин смерти и длительной инвалидности во всем мире1. Частота инсульта быстро увеличивается с возрастом, удваиваясь каждые 10 лет после 55лет 2 года. Ишемический инсульт возникает в результате нарушения мозгового кровотока вследствие тромботических и эмболических событий, которое охватывает более 80% всех случаев инсульта3. Даже в настоящее время существует относительно мало вариантов лечения, доступных для минимизации гибели тканей после ишемического инсульта. Существующие методы лечения чувствительны ко времени и, следовательно, не всегда приводят к хорошим клиническим результатам. Поэтому срочно необходимы исследования сложных клеточных механизмов ишемического инсульта, влияющих на постинсультное восстановление.
ГЭБ является динамическим интерфейсом для обмена молекулами между кровью и паренхимой мозга. Структурно ГЭБ состоит из микрососудистых эндотелиальных клеток мозга, соединенных между собой соединительными комплексами, окруженными базальной мембраной, перицитами и астроцитарным концом4. Перициты и астроциты играют существенную роль в поддержании целостности ГЭБ за счет секреции различных факторов, необходимых для образования сильных, плотных соединений 5,6. Распад ГЭБ является одной из отличительных черт ишемического инсульта. Острая воспалительная реакция и окислительный стресс, связанные с ишемией головного мозга, приводят к нарушению белковых комплексов плотного соединения и дисрегулируемых перекрестных помех между астроцитами, перицитами и эндотелиальными клетками, что приводит к увеличению параклеточной проницаемости растворенного вещества через ГЭБ7. Дисфункция ГЭБ дополнительно способствует образованию отека мозга и увеличивает риск геморрагической трансформации8. Учитывая все вышесказанное, существует большой интерес к пониманию молекулярных и клеточных изменений, которые происходят на уровне ГЭБ во время и после ишемического инсульта.
Хотя многие модели BBB in vitro были разработаны в течение последних десятилетий и использовались в различных исследованиях, ни одна из них не может полностью воспроизвести условия in vivo 9. В то время как некоторые модели основаны на монослоях эндотелиальных клеток, культивируемых на хорошо вставленных проницаемых опорах отдельно или в сочетании с перицитами или астроцитами, только более поздние исследования представили модели тройной клеточной культуры. Почти все существующие модели тройной культуры ГЭБ включают первичные эндотелиальные клетки мозга вместе с астроцитами и перицитами, выделенными из видов животных, или клетками, полученными из плюрипотентных стволовых клеток человека 10,11,12,13.
Признавая необходимость лучшего повторения человеческого ГЭБ in vitro, мы создали модель тройной клеточной культуры in vitro BBB, состоящую из микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга человека (HBMEC), первичных астроцитов человека (HA) и первичных сосудистых перицитов головного мозга человека (HBVP). Эта модель BBB с тройной культурой устанавливается на 6-луночную пластину, полиэфирные мембранные вставки с размером пор 0,4 мкм. Эти колодезные вставки обеспечивают оптимальную среду для прикрепления клеток и обеспечивают легкий доступ как к апикальным (кровь), так и к базолатеральным (мозг) отсекам для отбора проб среды или применения соединений. Особенности этой предложенной модели тройной клеточной культуры BBB оцениваются путем измерения TEER и параклеточного потока после OGD, имитирующего ишемический инсульт in vitro, с дефицитом кислорода (<1%O2) и питательных веществ (с использованием безглюсодержащей среды), достигаемой с использованием увлажненной, герметичной камеры. Кроме того, индуцированные ишемоподобные состояния в этой модели точно проверяются путем прямой визуализации гипоксических клеток.
В этом протоколе описан метод создания надежной тройной эндотелиальной клеточно-перицит-астроцитарной культуры модели ГЭБ для изучения дисфункции ГЭБ в условиях ишемического инсульта in vitro. Учитывая, что перициты являются ближайшими соседями эндотелиальных клеток in vivo, HBVP п…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH) MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 и DA047157.
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3450 | |
35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Life Sciences (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
Astrocyte Medium | Science Cell | 1801 | |
Attachment Factor | Cell Systems (Fisher Scientific) | 4Z0-201 | |
BD 60 mL Syringe | BD | 309653 | |
BrainPhys Imaging Optimized Medium | STEMCELL Technologies | 5791 | |
Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost | 4Z0-500 | Cell Systems | |
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap | VWR | 430829 | |
Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask | Corning | 431464U | |
Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3340 | |
Countes Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution | Fisher Scientific | 04-355-71 | |
Disposable Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) | ThermoFisher | A14430-01 | Glucose-free medium |
DPBS (No Calcium, No Magnesium) | ThermoFisher | 14190250 | |
EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL | Lonza | CC-3129 | |
EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes | World Precison Instruments | NC9792051 | Epithelial voltohmmeter |
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
Fluorview FV3000 Confocal Microscope | Olympus | FV3000 | |
Gas Tank (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) | Thermofisher | 14025092 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | |
Human Astrocytes | Science Cell | 1800 | |
Human Brain Vascular Pericytes | Science Cell | 1200 | |
Hypoxia Incubator Chamber | STEMCELL Technologies | 27310 | |
Image-iT Green Hypoxia Reagent | ThermoFisher | I14834 | |
Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ACBRI 376 | Cell Systems | |
Rocking Platform Shaker, Double | VWR | 10860-658 | |
Single Flow Meter | STEMCELL Technologies | 27311 | |
SpectraMax iD3 Microplate Reader | Molecular Devices | 75886-128 | |
Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile | NEST Scientific | 380121 | |
TPP Mutli-well Plates (6 wells) | MidSci | TP92406 | |
TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks | MidSci | TP90075 | Flasks with activated surface for cell adhesion |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 | |
UltraPure Distilled Water | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
Uno Stage Top Incubator- | Oko Lab | UNO-T-H-CO2-TTL |