Un triplo modello di coltura cellulare primaria della barriera emato-encefalica umana per lo studio dell'ictus ischemico in vitro

L’ictus è una delle principali cause di morte e disabilità a lungo termine in tutto il mondo¹. L’incidenza dell’ictus aumenta rapidamente con l’età, raddoppiando ogni 10 anni dopo i 55 anni². L’ictus ischemico si verifica a seguito di un’interruzione del flusso sanguigno cerebrale dovuta a eventi trombotici ed embolici, che comprende oltre l’80% di tutti i casi di ictus³. Anche ora, ci sono relativamente poche opzioni di trattamento disponibili per ridurre al minimo la morte dei tessuti dopo l’ictus ischemico. I trattamenti esistenti sono sensibili al tempo e di conseguenza non sempre portano a buoni risultati clinici. Pertanto, è urgentemente necessaria la ricerca sui complessi meccanismi cellulari dell’ictus ischemico che influenzano il recupero post-ictus.

La BBB è un’interfaccia dinamica per lo scambio di molecole tra il sangue e il parenchima cerebrale. Strutturalmente, la BBB è composta da cellule endoteliali microvascolari cerebrali interconnesse da complessi giunzionali circondati da una membrana basale, periciti e estremità astrocitiche⁴. Periti e astrociti svolgono un ruolo essenziale nel mantenimento dell’integrità della BEE attraverso la secrezione di vari fattori necessari per la formazione di giunzioni forti e strette ^5,6. La rottura della BBB è uno dei tratti distintivi dell’ictus ischemico. La risposta infiammatoria acuta e lo stress ossidativo associati all’ischemia cerebrale provocano la rottura dei complessi proteici a giunzione stretta e la diafonia disregolata tra astrociti, periciti e cellule endoteliali, che porta ad un aumento della permeabilità del soluto paracellulare attraverso la BBB⁷. La disfunzione della BEE promuove ulteriormente la formazione di edema cerebrale e aumenta il rischio di trasformazione emorragica⁸. Considerando tutto quanto sopra, c’è un grande interesse nella comprensione dei cambiamenti molecolari e cellulari che si verificano a livello di BBB durante e dopo l’ictus ischemico.

Sebbene molti modelli di BBB in vitro siano stati sviluppati negli ultimi decenni e utilizzati in una varietà di studi, nessuno di essi può replicare completamente le condizioni in vivo ⁹. Mentre alcuni modelli sono basati su monostrati di cellule endoteliali coltivati su supporti permeabili ben inseriti da soli o in combinazione con periciti o astrociti, solo studi più recenti hanno introdotto progetti di modelli di coltura cellulare tripla. Quasi tutti i modelli esistenti di tripla coltura BBB incorporano cellule endoteliali cerebrali primarie insieme ad astrociti e periciti isolati da specie animali o cellule derivate da cellule staminali pluripotenti umane^10,11,12,13.

Riconoscendo la necessità di ricapitolare meglio la BBB umana in vitro, abbiamo stabilito un modello di BBB in vitro con tripla coltura cellulare composto da cellule endoteliali microvascolari del cervello umano (HBMEC), astrociti umani primari (HA) e periciti vascolari primari del cervello umano (HBVP). Questo modello BBB a tripla coltura è impostato su inserti in membrana di poliestere a 6 pozzetti con dimensioni dei pori di 0,4 μm. Questi inserti forniscono un ambiente ottimale per l’attacco cellulare e consentono un facile accesso ai compartimenti apicali (sangue) e basolaterale (cervello) per il campionamento medio o l’applicazione di composti. Le caratteristiche di questo modello di BBB di coltura a tripla cellula proposto sono valutate misurando TEER e flusso paracellulare post OGD che imita l’ictus ischemico in vitro, con una carenza di ossigeno (<1% O₂) e nutrienti (utilizzando terreno privo di glucosio) ottenuta utilizzando una camera umidificata e sigillata. Inoltre, le condizioni ischemiche-simili indotte in questo modello sono accuratamente verificate mediante visualizzazione diretta delle cellule ipossiche.