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Immunology and Infection

Métodos de cultivo de espiroquetas de Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex y fiebre recidivante Borrelia

Published: November 25, 2022
doi:
10.3791/64431
, , , , , ,
1Department of Biology,Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology,Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences,Institute of Parasitology

Summary

El cultivo in vitro es un método de detección directa de la presencia de bacterias vivas. Este protocolo describe métodos para el cultivo de diversas espiroquetas de Borrelia, incluidas las del complejo Borrelia burgdorferi sensu lato, las especies de fiebre recidivante de Borrelia y Borrelia miyamotoi. Estas especies son fastidiosas y de crecimiento lento, pero pueden ser cultivadas.

Abstract

La Borrelia consiste en tres grupos de especies, las del grupo de la borreliosis de Lyme (LB), también conocido como B. burgdorferi sensu lato (s.l.) y recientemente reclasificado en Borreliella, el grupo de la fiebre recurrente (RF) Borrelia, y un tercer grupo de espiroquetas asociado a reptiles. Los métodos basados en el cultivo siguen siendo el estándar de oro para la detección de infecciones bacterianas en el laboratorio tanto para la investigación como para el trabajo clínico, ya que el cultivo de patógenos a partir de fluidos corporales o tejidos detecta directamente patógenos replicantes y proporciona material de origen para la investigación. Las espiroquetas de Borrelia y Borreliella son fastidiosas y de crecimiento lento, y por lo tanto no se cultivan comúnmente con fines clínicos; Sin embargo, la cultura es necesaria para la investigación. Este protocolo demuestra la metodología y las recetas necesarias para cultivar con éxito espiroquetas LB y RF, incluidas todas las especies reconocidas del complejo B. burgdorferi s.l., incluidas B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis yespiroquetas RF, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis y B. miyamotoi. El medio básico para cultivar espiroquetas LB y RF es el medio Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II o BSK-H), que apoya de manera confiable el crecimiento de espiroquetas en cultivos establecidos. Para poder cultivar aislados de Borrelia recién aislados a partir de muestras derivadas de garrapatas o huéspedes donde el número inicial de espiroquetas es bajo en el inóculo, se prefiere el medio Kelly-Pettenkofer (MKP) modificado. Este medio también apoya el crecimiento de B. miyamotoi. El éxito del cultivo de espiroquetas de RF también depende críticamente de la calidad de los ingredientes.

Introduction

Borrelia es un género de bacterias espiroquetas que abarca tres clados principales: el grupo de la borreliosis de Lyme (LB), el grupo de la fiebre recurrente (RF) y un grupo menos caracterizado aparentemente restringido a los reptiles. La taxonomía de Borrelia está en constante cambio con el advenimiento de metodologías moleculares que permiten comparaciones de genomas y proteomas, como ocurre con la mayoría de los otros grupos taxonómicos 1,2,3,4,5,6,7. El grupo LB (también llamado grupo de la enfermedad de Lyme) se ha denominado tradicionalmente Borrelia burgdorferi sensu lato después de su miembro mejor caracterizado Borrelia burgdorferi sensu stricto.  Este artículo utiliza la terminología más utilizada actualmente: el LB, el RF y el grupo asociado a reptiles, y describe los protocolos de cultivo para los grupos LB y RF.

Como se esperaría para un miembro de la familia Spirochaetaceae, Borrelia puede adoptar la forma espiral distintivamente larga y delgada, típicamente 20-30 μm de largo y 0.2-0.3 μm de ancho. Sin embargo, las células de Borrelia son altamente pleomórficas y pueden adoptar muchas otras formas tanto en cultivo como in vivo 1,8 como resultado de su compleja estructura celular y genética. En su forma espiroquetal, la morfología de la onda sinusoidal plana resulta de su endoflagelos axiales que giran en el espacio periplásmico entre las membranas interna y externa. Esta estructura permite que las células sean altamente móviles, con la membrana externa que contiene proteínas que permiten a la célula interactuar con los tejidos del huésped 9,10. La expresión de las proteínas de la membrana externa está estrechamente regulada y afecta no sólo la invasión del tejido del huésped, sino también la interacción con el sistema inmune del huésped11. Esta compleja expresión génica permite que las células de Borrelia se muevan entre los entornos muy diferentes de los huéspedes vertebrados y los vectores invertebrados. El genoma de Borrelia es inusual entre los procariotas, que consiste en un cromosoma lineal en lugar de circular. Además del cromosoma lineal, las especies de Borrelia contienen 7-21 plásmidos, algunos lineales y otros circulares. Los plásmidos albergan la mayoría de los genes necesarios para la adaptación y virulencia del huésped, y se cree que los plásmidos circulares derivados de los profagos son responsables de la mayor parte del flujo horizontal de genes entre las células espiroquetales12,13. De acuerdo con un papel en la adaptación del huésped, algunos, posiblemente muchos o todos, los miembros del grupo de borreliosis de Lyme pierden plásmidos en cultivo14. La cepa “adaptada en laboratorio” mejor estudiada de B. burgdorferi, B31, tiene solo siete de los nueve plásmidos encontrados en aislados silvestres de esta especie15. Del mismo modo, B. garinii pierde plásmidos en cultivo16. Algunos estudios han demostrado que las especies de RF y B. miyamotoi retienen plásmidos cuando se cultivan 14,17, pero trabajos recientes demuestran plásmidos alterados e infectividad con el cultivo in vitro a largo plazo18.

Los métodos basados en el cultivo siguen siendo el estándar de oro para la detección de infecciones bacterianas en laboratorio, tanto para la investigación como para el trabajo clínico14,17. El cultivo de patógenos a partir de fluidos corporales o tejidos detecta directamente patógenos replicantes y proporciona material de origen para la investigación14,17. Este protocolo demuestra la metodología y las recetas necesarias para cultivar con éxito las espiroquetas del grupo LB, así como RF Borrelia y B. miyamotoi. El medio básico para cultivar espiroquetas de Borrelia es el medio Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II o el BSK-H disponible comercialmente), con o sin antibióticos para reducir el crecimiento de procariotas contaminantes. Este medio fue adaptado de un medio utilizado originalmente para soportar RF Borrelia19, modificado por Stoenner20 y luego por Barbour21. Desde entonces, se han desarrollado muchas modificaciones, cada una con efectos sobre la fisiología bacteriana que pueden afectar el crecimiento, la infectividad y la patogenicidad22. Este medio apoya de manera confiable el crecimiento de espiroquetas en cultivos establecidos y ha sido utilizado para aislar espiroquetas de garrapatas, mamíferos y muestras clínicas23. La variación desarrollada más recientemente, el medio Kelly-Pettenkofer (MKP) modificado, puede proporcionar un mejor éxito de aislamiento, morfología y motilidad al aislar nuevos aislados de Borrelia de muestras ambientales, cuando el número de espiroquetas presentes en la muestra disponible para sembrar el cultivo es bajo23,24. En todos los casos, el éxito del cultivo depende críticamente del medio recién preparado y del uso de ingredientes apropiados; No todos los ingredientes comerciales producen medios de alta calidad. Los cultivos inoculados pueden incubarse convenientemente sin agitar en una incubadora convencional a 32-34 °C en presencia de una pequeña cantidad de oxígeno ambiental residual. Las espiroquetas de Borrelia son anaerobias, pero están expuestas en la naturaleza a fluctuaciones en las concentraciones de oxígeno y dióxido de carbono y responden con cambios en la expresión génica26,27,28,29. Por lo tanto, la expresión génica, el crecimiento y otros estudios metabólicos deben controlar los niveles de oxígeno y dióxido de carbono con el uso de una incubadora controlada por oxígeno o una cámara anaeróbica. En cultivo, los cultivos se revisan semanalmente, o más a menudo, para detectar la presencia de espiroquetas con microscopía de campo oscuro o microscopía de contraste de fase. Los frotis de cultivo se pueden teñir con tinciones de plata, inmunohistoquímica o mediante el uso de cepas marcadas con fluorescencia29,30. La PCR seguida de secuenciación del ADN es un método sensible y específico para detectar e identificar genéticamente o confirmar la especie Borrelia 30,31,32,33.

Existen muchas variaciones menores en BSK-II, y algunas están disponibles comercialmente. El protocolo descrito aquí en la sección 1 ha sido adaptado de Barbour (1984)21. El medio MKP líquido es un medio desarrollado más recientemente y se describe en la sección 2. Se prepara de acuerdo con un protocolo previamente reportado33,34, que, al igual que el medio BSK, consta de dos pasos: preparación del medio básico y preparación del medio completo. El medio de cultivo de Borrelia se puede preparar con o sin antibióticos, como se describe en la sección 3; los antibióticos actúan para reducir las bacterias contaminantes introducidas al inocular con muestras clínicas o ambientales, como se describe en la sección 4; si se inocula con cultivo puro de Borrelia sp., es posible que no se necesiten antibióticos. La fabricación de existencias de Borrelia a largo plazo es a menudo importante, y un protocolo para hacerlo se describe en la sección 5. La Sección 6 describe el uso de estos medios para aislar clones puros de Borrelia sensu lato de muestras clínicas o ambientales. Hay una serie de enfoques posibles36; A continuación se muestra uno que se encuentra para ser eficaz. El medio de recubrimiento utilizado en este protocolo es una modificación del medio de recubrimiento BSK-II37 y del medio MKP34 (con suero de conejo aumentado al 10%38).

Protocol

Todos los estudios con muestras obtenidas de sujetos humanos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad y/o centro médico correspondiente, y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los participantes antes de que se recolectaran las muestras. Todos los estudios con muestras obtenidas de animales fueron aprobados y realizados bajo los lineamientos del Comité Institucional de Ética Animal. En su caso, se han obtenido aprobaciones para el muestreo ambiental. <p class="jove_…

Representative Results

Los medios de cultivo de Borrelia BSK y MKP, y sus variantes, son medios de cultivo ricos con ingredientes que deben prepararse y esterilizarse secuencialmente. Cuando se prepara correctamente, el medio BSK debe ser rojo-naranja y transparente (Figura 1). La turbidez y la precipitación que persisten después del calentamiento indican ingredientes problemáticos, producción media o contaminación; Tal medio es mejor descartarlo. Si se añade gelatina a BSK y con MKP, el medio será…

Discussion

El cultivo de bacterias en laboratorio es el trampolín para la investigación. La profunda ventaja conferida por la capacidad de cultivar se ejemplifica en la lucha, durante más de un siglo que culminó recientemente en éxito, para cultivar Treponema pallidum, la espiroqueta que es el agente etiológico de la sífilis44. Las espiroquetas de Borrelia también son difíciles de cultivar, pero la cultura es posible 23,24,34,44,45,46,47,48,49.<su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue parcialmente apoyado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá y la Fundación Canadiense de la Enfermedad de Lyme (AB y VL), el Consejo Sueco de Investigación (SB, M-LF e IN), el proyecto TAČR GAMA 2 – “Apoyo a la verificación del potencial de aplicación 2.0 en el Centro de Biología CAS” (TP01010022) (MG y NR), y por una subvención del Ministerio de Salud de la República Checa NV19-05-00191 (MG y NR). Agradecemos a S. Vranjes (2021, Rudenko lab) por la imagen de la Figura 4 y a J. Thomas-Ebbett (2021, Lloyd lab) por las imágenes de la Figura 5. Agradecemos a todos los investigadores que han contribuido al campo y pedimos disculpas a aquellos cuyo trabajo no pudimos citar debido a limitaciones de espacio.

Materials

1.7 mL tubes VWR 87003-294 Standard item – any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter  VWR 28145-501 Standard item – any supplier will do
10 µL barrier pipette tip Neptune BT10XLS3 Standard item – any supplier will do
10 mL Serological pipettes  Celltreat 229011B Standard item – any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip Neptune BT1000.96 Standard item – any supplier will do
15 mL tube Celltreat 188261 Standard item – any supplier will do
20 µL barrier pipette tip Neptune BT20 Standard item – any supplier will do
20 mL Sterile syringe  BD 309661 Standard item – any supplier will do
200 µL barrier pipette tip Neptune BT200 Standard item – any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes Fisher Scientific 14-933C Standard item – any supplier will do
25 mL Serological pipettes Celltreat 229025B Standard item – any supplier will do
3 mL Sterile syringe BD 309657 Standard item – any supplier will do
35% BSA  Sigma A-7409 Source is important – see note
5 mL Serological pipettes  Celltreat 229006B Standard item – any supplier will do
50 mL tube Celltreat 229421 Standard item – any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes  Schott Schott Nr. 26 135 115 Standard item – any supplier will do
Amikacine Sigma PHR1654 Standard item – any supplier will do
Amphotericin B Sigma A9528-100MG Standard item – any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole Sigma PHR1126-1G Standard item – any supplier will do
BBL Brucella broth  BD 211088 Standard item – any supplier will do
Biosafety Cabinet Labconco 302419100 Standard item – any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top – ACD) Fisher Scientific BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) Standard item – any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]  Darlynn biologicals BB83-500 Standard item – any supplier will do
centrifuge  Eppendorf model 5430 Standard item – any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate Sigma C-8532 100 g Standard item – any supplier will do
CMRL Gibco BRL 21540 500 mL Standard item – any supplier will do
CMRL-1066 Gibco 21-510-018 Standard item – any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene) Fisher Scientific 5000-0020 Standard item – any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm Sigma P7741 Standard item – any supplier will do
Digital Incubator VWR model 1545 Standard item – any supplier will do
DMSO ThermoFisher D12345 Standard item – any supplier will do
Filters for filter sterilization Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane SCGPU05RE Standard item – any supplier will do
Gelatin Difco BD 214340 500 g Standard item – any supplier will do
Glass Culture Tubes Fisher Scientific 99449-20 Standard item – any supplier will do
Glucose Sigma G-7021 1 kg Standard item – any supplier will do
Glycerol Sigma G5516 Standard item – any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) Labwissen Model 3220 Standard item – any supplier will do
HEPES Sigma  H-3784 100 g Standard item – any supplier will do
N-acetylglucoseamine Sigma  A-3286 25 g Standard item – any supplier will do
Neopeptone Difco  BD 211681 500 g Standard item – any supplier will do
Neubauer Hematocytometer Sigma  Z359629 Standard item – any supplier will do
Phase contrast microscope  Leitz Standard item – any supplier will do
Phosphomycin Sigma P5396-1G Standard item – any supplier will do
Phosphomycine Sigma P5396 Standard item – any supplier will do
Pipetboy Integra Standard item – any supplier will do
Precision Standard Balance OHAUS model TS200S Standard item – any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt) Sigma P-8574 25 g Standard item – any supplier will do
Rabbit Serum  Gibco 16-120-032 Source is important 
Rabbit Serum  Sigma R-4505  100 mL Source is important 
Rifampicin Sigma R3501-1G Standard item – any supplier will do
Sodium bicarbonate Sigma S-5761     500 g Standard item – any supplier will do
Sufametaxazole  Sigma PHR1126 Standard item – any supplier will do
TC Yeastolate Difco  BD 255752 100 g Standard item – any supplier will do
Transfer Pipettes VWR 470225-044 Standard item – any supplier will do
Trimethoprim Sigma PHR1056 Standard item – any supplier will do
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References

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Berthold, A., Faucillion, M., Nilsson, I., Golovchenko, M., Lloyd, V., Bergström, S., Rudenko, N. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp. (189), e64431, doi:10.3791/64431 (2022).
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