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Immunology and Infection

Métodos de Cultivo de Espiroquetas do Complexo Borrelia burgdorferi Sensu Lato e Borrelia de Febre Recidivante

Published: November 25, 2022
doi:
10.3791/64431
, , , , , ,
1Department of Biology,Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology,Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences,Institute of Parasitology

Summary

O cultivo in vitro é um método de detecção direta da presença de bactérias vivas. Este protocolo descreve métodos para o cultivo de diversas espiroquetas de Borrelia, incluindo as do complexo Borrelia burgdorferi sensu lato, espécies de Borrelia de febre recidivante e Borrelia miyamotoi. Estas espécies são fastidiosas e de crescimento lento, mas podem ser cultivadas.

Abstract

A Borrelia é composta por três grupos de espécies, as do grupo Borreliose de Lyme (LB), também conhecidas como B. burgdorferi sensu lato (s.l.) e recentemente reclassificadas em Borreliella, o grupo da febre recidivante (FR) Borrelia, e um terceiro grupo de espiroquetas associado a répteis. Os métodos baseados em cultura continuam sendo o padrão-ouro para a detecção laboratorial de infecções bacterianas tanto para pesquisa quanto para trabalhos clínicos, pois a cultura de patógenos a partir de fluidos corporais ou tecidos detecta diretamente patógenos replicantes e fornece material de origem para pesquisa. As espiroquetas de Borrelia e Borreliella são fastidiosas e de crescimento lento e, portanto, não são comumente cultivadas para fins clínicos; no entanto, a cultura é necessária para a pesquisa. Este protocolo demonstra a metodologia e as receitas necessárias para cultivar com sucesso espiroquetas LB e RF, incluindo todas as espécies reconhecidas do complexo B. burgdorferi s.l., incluindo B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis eespiroquetas RF, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis e B. miyamotoi. O meio básico para o cultivo de espiroquetas LB e RF é o meio Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II ou BSK-H), que suporta de forma confiável o crescimento de espiroquetas em culturas estabelecidas. Para poder cultivar isolados de Borrelia recém-isolados a partir de amostras derivadas de carrapatos ou hospedeiros onde o número inicial de espiroquetas é baixo no inóculo, o meio Kelly-Pettenkofer (MKP) modificado é preferido. Este meio também suporta o crescimento de B. miyamotoi. O sucesso do cultivo de espiroquetas de RF também depende criticamente da qualidade dos ingredientes.

Introduction

Borrelia é um gênero de bactérias espiroquetas que engloba três clados principais: o grupo da borreliose de Lyme (LB), o grupo da febre recidivante (FR) e um grupo menos bem caracterizado, aparentemente restrito aos répteis. A taxonomia da borrelia está em mutação com o advento de metodologias moleculares que permitem comparações genômicas e proteômicas, como ocorre com a maioria dos outros grupos taxonômicos1,2,3,4,5,6,7. O grupo LB (também chamado de grupo da doença de Lyme) tem sido tradicionalmente denominado Borrelia burgdorferi sensu lato em homenagem ao seu membro mais bem caracterizado Borrelia burgdorferi sensu stricto. Este trabalho utiliza a terminologia mais utilizada atualmente: NV, FR e grupo associado a répteis, e descreve os protocolos de cultura para os grupos LB e RF.

Como seria esperado para um membro da família Spirochaetaceae, Borrelia pode adotar a forma espiral distintamente longa e fina, tipicamente 20-30 μm de comprimento e 0,2-0,3 μm de largura. No entanto, as células de Borrelia são altamente pleomórficas e podem adotar muitas outras formas tanto em cultura quanto in vivo 1,8 como resultado de sua complexa estrutura celular e genética. Em sua forma espiroquetada, a morfologia planar da onda senoidal resulta da rotação de seus endoflagelos axiais no espaço periplasmático entre as membranas interna e externa. Essa estrutura permite que as células sejam altamente móveis, com a membrana externa contendo proteínas que permitem que a célula interaja com os tecidos do hospedeiro 9,10. A expressão das proteínas da membrana externa é fortemente regulada e afeta não só a invasão do tecido do hospedeiro, mas também a interação com o sistema imune do hospedeiro11. Esta expressão gênica complexa permite que as células de Borrelia transitem entre os ambientes muito diferentes de hospedeiros vertebrados e vetores invertebrados. O genoma da Borrelia é incomum entre os procariontes, consistindo de um cromossomo linear em vez de circular. Além do cromossomo linear, as espécies de Borrelia contêm 7-21 plasmídeos, alguns lineares e outros circulares. Os plasmídeos abrigam a maioria dos genes necessários para a adaptação e virulência do hospedeiro, e acredita-se que os plasmídeos circulares derivados de prófagos sejam responsáveis pela maior parte do fluxo gênico horizontal entre as células espiroquetas12,13. Consistente com um papel na adaptação do hospedeiro, alguns, possivelmente muitos ou todos, membros do grupo da borreliose de Lyme perdem plasmídeos em cultura14. A cepa “adaptada em laboratório” de B. burgdorferi, B31, mais bem estudada, possui apenas sete dos nove plasmídeos encontrados em isolados silvestres dessaespécie15. Da mesma forma, B. garinii perde plasmídeos em cultura16. Alguns estudos têm demonstrado que espécies de RF e B. miyamotoi retêm plasmídeos quando cultivados14,17, mas trabalhos recentes demonstram plasmídeos alterados e infectividade com cultivo in vitro de longa duração18.

Os métodos baseados em cultura continuam sendo o padrão-ouro para a detecção laboratorial de infecções bacterianas, tanto para pesquisa quanto para o trabalho clínico14,17. A cultura de patógenos a partir de fluidos corporais ou tecidos detecta diretamente patógenos replicantes e fornece material de origem para pesquisa14,17. Este protocolo demonstra a metodologia e as receitas necessárias para o cultivo com sucesso das espiroquetas do grupo LB, bem como da RF Borrelia e B. miyamotoi. O meio básico para o cultivo de espiroquetas de Borrelia é o meio Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II ou BSK-H comercialmente disponível), com ou sem antibióticos para reduzir o crescimento de procariontes contaminantes. Este meio foi adaptado de um meio originalmente usado para suportar RF Borrelia19, posteriormente modificado por Stoenner20 e depois por Barbour21. Desde então, muitas modificações foram desenvolvidas, cada uma com efeitos sobre a fisiologia bacteriana que podem afetar o crescimento, a infectividade e a patogenicidade22. Esse meio suporta de forma confiável o crescimento de espiroquetas em culturas estabelecidas e tem sido usado para isolar espiroquetas de amostras clínicas de carrapatos, mamíferos e23. A variação mais recentemente desenvolvida, meio Kelly-Pettenkofer modificado (MKP), pode proporcionar melhor sucesso de isolamento, morfologia e motilidade ao isolar novos isolados de Borrelia de amostras ambientais, quando o número de espiroquetas presentes na amostra disponível para semear a cultura é baixo23,24. Em todos os casos, o sucesso do cultivo depende criticamente do meio recém-preparado e do uso de ingredientes apropriados; Nem todos os ingredientes comerciais produzem meios de alta qualidade. As culturas inoculadas podem ser convenientemente incubadas sem agitação em uma incubadora convencional de 32-34 °C na presença de uma pequena quantidade de oxigênio ambiente residual. As espiroquetas de Borrelia são anaeróbias, mas estão expostas na natureza a flutuações nas concentrações de oxigênio e dióxido de carbono e respondem com alterações na expressão gênica26,27,28,29. Assim, a expressão gênica, o crescimento e outros estudos metabólicos devem controlar os níveis de oxigênio e dióxido de carbono com o uso de uma incubadora ou câmara anaeróbia controlada por oxigênio. Em cultura, as culturas são verificadas semanalmente, ou mais frequentemente, para a presença de espiroquetas com microscopia de campo escuro ou microscopia de contraste de fase. Os esfregaços de cultura podem ser corados com coloração de prata, imunohistoquímica ou pelo uso de cepas fluorescentemente marcadas29,30. A PCR seguida de sequenciamento de DNA é um método sensível e específico para detectar e identificar geneticamente ou confirmar a espécie de Borrelia 30,31,32,33.

Muitas pequenas variações no BSK-II existem, e algumas estão disponíveis comercialmente. O protocolo aqui descrito na seção 1 foi adaptado de Barbour (1984)21. O meio MKP líquido é um meio desenvolvido mais recentemente e é descrito na seção 2. É preparado de acordo com um protocolo previamenterelatado33,34, que, à semelhança do meio BSK, consiste em duas etapas: preparação do meio básico e preparação do meio completo. O meio de cultura de borrelia pode ser preparado com ou sem antibióticos, conforme descrito na seção 3; os antibióticos atuam para reduzir as bactérias contaminantes introduzidas ao inocular com amostras clínicas ou ambientais, conforme descrito na seção 4; se inocular com cultura pura de Borrelia sp., antibióticos podem não ser necessários. A criação de existências de Borrelia a longo prazo é frequentemente importante, e um protocolo para o fazer é descrito na secção 5. A seção 6 descreve o uso desses meios para isolar clones puros de Borrelia sensu lato de amostras clínicas ou ambientais. Há uma série de abordagens possíveis36; abaixo está um encontrado para ser eficaz. O meio de plaqueamento utilizado neste protocolo é uma modificação do meio de plaqueamento BSK-II37 e do meio MKP34 (com soro de coelho aumentado para 10%38).

Protocol

Todos os estudos envolvendo amostras obtidas de seres humanos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da universidade e/ou centro médico relevante, e o consentimento informado por escrito foi obtido dos participantes antes que as amostras fossem coletadas. Todos os estudos envolvendo amostras obtidas de animais foram aprovados e conduzidos sob as diretrizes do Comitê de Ética Animal da Instituição. Se for caso disso, foram obtidas aprovações para a amostragem ambiental. NOTA:…

Representative Results

Os meios de cultura Borrelia BSK e MKP, e variantes, são meios de cultura ricos com ingredientes que precisam ser preparados e esterilizados sequencialmente. Quando bem preparado, o meio BSK deve ser vermelho-alaranjado e límpido (Figura 1). Turbidez e precipitação que persistem após o aquecimento indicam ingredientes problemáticos, produção média ou contaminação; Esse meio é melhor descartado. Se for adicionada gelatina à BSK e com MKP, o meio será gelatinoso quando r…

Discussion

A cultura laboratorial de bactérias é o trampolim para a pesquisa. A profunda vantagem conferida pela capacidade de cultura é exemplificada pela luta, ao longo de mais de um século culminando apenas recentemente em sucesso, para a cultura do Treponema pallidum, a espiroqueta que é o agente etiológico da sífilis44. As espiroquetas de Borrelia também são desafiadoras para a cultura, mas a cultura é possível 23,24,34,44,45,46,47,48,49.<s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo Natural Science and Engineering Research Council of Canada e pela Canadian Lyme disease Foundation (AB e VL), pelo Swedish Research Council (SB, M-LF e IN), TAČR GAMA 2 project – “Support of application potential verification 2.0 at the Biology Centre CAS” (TP01010022) (MG e NR), e por uma bolsa do Ministério da Saúde da República Tcheca NV19-05-00191 (MG e NR). Agradecemos a S. Vranjes (2021, laboratório Rudenko) pela imagem na Figura 4 e a J. Thomas-Ebbett (2021, laboratório Lloyd) pelas imagens na Figura 5. Agradecemos a todos os pesquisadores que contribuíram com a área e pedimos desculpas àqueles cujos trabalhos não pudemos citar por limitações de espaço.

Materials

1.7 mL tubes VWR 87003-294 Standard item – any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter  VWR 28145-501 Standard item – any supplier will do
10 µL barrier pipette tip Neptune BT10XLS3 Standard item – any supplier will do
10 mL Serological pipettes  Celltreat 229011B Standard item – any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip Neptune BT1000.96 Standard item – any supplier will do
15 mL tube Celltreat 188261 Standard item – any supplier will do
20 µL barrier pipette tip Neptune BT20 Standard item – any supplier will do
20 mL Sterile syringe  BD 309661 Standard item – any supplier will do
200 µL barrier pipette tip Neptune BT200 Standard item – any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes Fisher Scientific 14-933C Standard item – any supplier will do
25 mL Serological pipettes Celltreat 229025B Standard item – any supplier will do
3 mL Sterile syringe BD 309657 Standard item – any supplier will do
35% BSA  Sigma A-7409 Source is important – see note
5 mL Serological pipettes  Celltreat 229006B Standard item – any supplier will do
50 mL tube Celltreat 229421 Standard item – any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes  Schott Schott Nr. 26 135 115 Standard item – any supplier will do
Amikacine Sigma PHR1654 Standard item – any supplier will do
Amphotericin B Sigma A9528-100MG Standard item – any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole Sigma PHR1126-1G Standard item – any supplier will do
BBL Brucella broth  BD 211088 Standard item – any supplier will do
Biosafety Cabinet Labconco 302419100 Standard item – any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top – ACD) Fisher Scientific BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) Standard item – any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]  Darlynn biologicals BB83-500 Standard item – any supplier will do
centrifuge  Eppendorf model 5430 Standard item – any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate Sigma C-8532 100 g Standard item – any supplier will do
CMRL Gibco BRL 21540 500 mL Standard item – any supplier will do
CMRL-1066 Gibco 21-510-018 Standard item – any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene) Fisher Scientific 5000-0020 Standard item – any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm Sigma P7741 Standard item – any supplier will do
Digital Incubator VWR model 1545 Standard item – any supplier will do
DMSO ThermoFisher D12345 Standard item – any supplier will do
Filters for filter sterilization Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane SCGPU05RE Standard item – any supplier will do
Gelatin Difco BD 214340 500 g Standard item – any supplier will do
Glass Culture Tubes Fisher Scientific 99449-20 Standard item – any supplier will do
Glucose Sigma G-7021 1 kg Standard item – any supplier will do
Glycerol Sigma G5516 Standard item – any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) Labwissen Model 3220 Standard item – any supplier will do
HEPES Sigma  H-3784 100 g Standard item – any supplier will do
N-acetylglucoseamine Sigma  A-3286 25 g Standard item – any supplier will do
Neopeptone Difco  BD 211681 500 g Standard item – any supplier will do
Neubauer Hematocytometer Sigma  Z359629 Standard item – any supplier will do
Phase contrast microscope  Leitz Standard item – any supplier will do
Phosphomycin Sigma P5396-1G Standard item – any supplier will do
Phosphomycine Sigma P5396 Standard item – any supplier will do
Pipetboy Integra Standard item – any supplier will do
Precision Standard Balance OHAUS model TS200S Standard item – any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt) Sigma P-8574 25 g Standard item – any supplier will do
Rabbit Serum  Gibco 16-120-032 Source is important 
Rabbit Serum  Sigma R-4505  100 mL Source is important 
Rifampicin Sigma R3501-1G Standard item – any supplier will do
Sodium bicarbonate Sigma S-5761     500 g Standard item – any supplier will do
Sufametaxazole  Sigma PHR1126 Standard item – any supplier will do
TC Yeastolate Difco  BD 255752 100 g Standard item – any supplier will do
Transfer Pipettes VWR 470225-044 Standard item – any supplier will do
Trimethoprim Sigma PHR1056 Standard item – any supplier will do
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References

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Berthold, A., Faucillion, M., Nilsson, I., Golovchenko, M., Lloyd, V., Bergström, S., Rudenko, N. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp. (189), e64431, doi:10.3791/64431 (2022).
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