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Immunology and Infection

Kultivierungsmethoden von Spirochäten aus Borrelia burgdorferi , Sensu Lato Complex und Rezidivfieber Borrelien

Published: November 25, 2022
doi:
10.3791/64431
, , , , , ,
1Department of Biology,Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology,Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences,Institute of Parasitology

Summary

Die In-vitro-Kultur ist eine direkte Nachweismethode für das Vorhandensein lebender Bakterien. Dieses Protokoll beschreibt Methoden für die Kultivierung verschiedener Borrelien-Spirochäten, einschließlich der Borrelia burgdorferi sensu lato-Komplexes, der Rezidivfieber-Borrelienarten und der Borrelia miyamotoi. Diese Arten sind anspruchsvoll und wachsen langsam, können aber kultiviert werden.

Abstract

Die Borrelien bestehen aus drei Artengruppen, der Lyme-Borreliose-Gruppe (LB), die auch als B. burgdorferi sensu lato (s.l.) bekannt ist und kürzlich in Borreliella, die Rückfallfiebergruppe (RF) Borrelien und eine dritte reptilienassoziierte Gruppe von Spirochäten umklassifiziert wurde. Kulturbasierte Methoden sind nach wie vor der Goldstandard für den Labornachweis bakterieller Infektionen sowohl für die Forschung als auch für die klinische Arbeit, da die Kultivierung von Krankheitserregern aus Körperflüssigkeiten oder Geweben replizierende Krankheitserreger direkt detektiert und Ausgangsmaterial für die Forschung liefert. Borrelien und Borreliella-Spirochäten sind anspruchsvoll und langsam wachsend und werden daher üblicherweise nicht für klinische Zwecke kultiviert. Für die Forschung ist jedoch Kultur notwendig. Dieses Protokoll demonstriert die Methodik und die Rezepturen, die für die erfolgreiche Kultivierung von LB- und RF-Spirochäten erforderlich sind, einschließlich aller anerkannten Arten aus dem B. burgdorferi s.l.-Komplex, einschließlich B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis undRF-Spirochäten, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis und B. miyamotoi. Das Basismedium für die Zucht von LB- und RF-Spirochäten ist das Barbour-Stoenner-Kelly-Medium (BSK-II oder BSK-H), das das Wachstum von Spirochäten in etablierten Kulturen zuverlässig unterstützt. Um neu isolierte Borrelienisolate aus Zecken- oder Wirtsproben züchten zu können, bei denen die anfängliche Spirochätenzahl im Inokulum niedrig ist, wird modifiziertes Kelly-Pettenkofer (MKP)-Medium bevorzugt. Dieses Medium unterstützt auch das Wachstum von B. miyamotoi. Der Erfolg der Kultivierung von RF-Spirochäten hängt auch entscheidend von der Qualität der Inhaltsstoffe ab.

Introduction

Borrelien sind eine Gattung von Spirochätenbakterien, die drei Hauptgruppen umfasst: die Gruppe der Lyme-Borreliose (LB), die Gruppe des Rückfallfiebers (RF) und eine weniger gut charakterisierte Gruppe, die anscheinend auf Reptilien beschränkt ist. Die Borrelien-Taxonomie ist mit dem Aufkommen molekularer Methoden, die Genom- und Proteomvergleiche ermöglichen, im Fluss, wie es bei den meisten anderen taxonomischen Gruppen der Fall ist 1,2,3,4,5,6,7. Die LB-Gruppe (auch Borreliose-Gruppe genannt) wird traditionell als Borrelia burgdorferi sensu lato bezeichnet, nach ihrem am besten charakterisierten Mitglied Borrelia burgdorferi sensu stricto. In diesem Artikel wird die derzeit am weitesten verbreitete Terminologie verwendet: die LB-, die RF- und die Reptilien-assoziierte Gruppe, und die Kulturprotokolle für die LB- und die RF-Gruppe beschrieben.

Wie für ein Mitglied der Familie Spirochaetaceae zu erwarten, können Borrelien die charakteristisch lange und dünne Spiralform annehmen, typischerweise 20-30 μm lang und 0,2-0,3 μm breit. Borrelienzellen sind jedoch hochgradig pleomorph und können aufgrund ihrer komplexen zellulären und genetischen Struktur sowohl in Kultur als auch in vivo viele andere Formen annehmen 1,8. In seiner Spirochätalform resultiert die planare Sinuswellenmorphologie aus der Rotation der axialen Endoflagellen im periplasmatischen Raum zwischen der inneren und äußeren Membran. Diese Struktur ermöglicht es den Zellen, sehr beweglich zu sein, wobei die äußere Membran Proteine enthält, die es der Zelle ermöglichen, mit dem Wirtsgewebe zu interagieren 9,10. Die Expression der Proteine der äußeren Membran ist streng reguliert und beeinflusst nicht nur die Invasion des Wirtsgewebes, sondern auch die Interaktion mit dem Immunsystem des Wirts11. Diese komplexe Genexpression ermöglicht es den Borrelienzellen, zwischen den sehr unterschiedlichen Umgebungen von Wirbeltierwirten und wirbellosen Vektoren zu pendeln. Das Genom von Borrelien ist bei Prokaryoten ungewöhnlich und besteht aus einem linearen und nicht aus einem zirkulären Chromosom. Neben dem linearen Chromosom enthalten Borrelien-Arten 7-21 Plasmide, einige linear und einige kreisförmig. Die Plasmide beherbergen die Mehrheit der Gene, die für die Anpassung und Virulenz des Wirts erforderlich sind, und es wird angenommen, dass die zirkulären Plasmide, die aus Prophagen stammen, für den Großteil des horizontalen Genflusses zwischen Spirochätalzellen verantwortlichsind 12,13. In Übereinstimmung mit einer Rolle bei der Wirtsanpassung verlieren einige, möglicherweise viele oder alle Mitglieder der Lyme-Borreliose-Gruppe Plasmide in Kultur14. Der am besten untersuchte “laborangepasste” Stamm von B. burgdorferi, B31, weist nur sieben der neun Plasmide auf, die in Wildisolaten dieser Art gefunden wurden15. In ähnlicher Weise verliert B. garinii Plasmide in Kultur16. Einige Studien haben gezeigt, dass RF-Spezies und B. miyamotoi Plasmide behalten, wenn sie kultiviert werden 14,17, aber neuere Arbeiten zeigen veränderte Plasmide und Infektiosität bei langfristiger In-vitro-Kultivierung 18.

Kulturbasierte Methoden sind nach wie vor der Goldstandard für den Labornachweis bakterieller Infektionen, sowohl für die Forschung als auch für die klinische Arbeit14,17. Die Kultivierung von Krankheitserregern aus Körperflüssigkeiten oder Geweben detektiert direkt replizierende Krankheitserreger und liefert Ausgangsmaterial für die Forschung14,17. Dieses Protokoll demonstriert die Methodik und die Rezepturen, die für die erfolgreiche Kultivierung der Spirochäten der LB-Gruppe sowie von RF-Borrelien und B. miyamotoi erforderlich sind. Das Basismedium für die Züchtung von Borrelia-Spirochäten ist das Barbour-Stoenner-Kelly-Medium (BSK-II oder das kommerziell erhältliche BSK-H), mit oder ohne Antibiotika, um das Wachstum kontaminierender Prokaryoten zu reduzieren. Dieses Medium wurde von einem Medium adaptiert, das ursprünglich zur Unterstützung von RF Borrelia19 verwendet wurde, und wurde von Stoenner20 und dann von Barbour21 weiter modifiziert. Seitdem wurden viele Modifikationen entwickelt, von denen jede Auswirkungen auf die bakterielle Physiologie hat, die das Wachstum, die Infektiosität und die Pathogenität beeinflussen können22. Dieses Medium unterstützt zuverlässig das Wachstum von Spirochäten in etablierten Kulturen und wurde verwendet, um Spirochäten aus Zecken-, Säugetier- und klinischen Proben zu isolieren23. Die neuere Variante, modifiziertes Kelly-Pettenkofer (MKP)-Medium, kann bei der Isolierung neuer Borrelienisolate aus Umweltproben einen besseren Isolationserfolg, eine bessere Morphologie und eine bessere Motilität bieten, wenn die Anzahl der in der Probe vorhandenen Spirochäten, die für die Aussaat der Kultur zur Verfügung stehen, gering ist23,24. In allen Fällen hängt der Erfolg der Kultivierung entscheidend vom frisch zubereiteten Medium und der Verwendung geeigneter Zutaten ab. Nicht alle kommerziellen Inhaltsstoffe produzieren ein hochwertiges Medium. Beimpfte Kulturen können bequem und ohne Schütteln in einem herkömmlichen Inkubator bei 32-34 °C in Gegenwart einer geringen Menge an Restsauerstoff in der Umgebung inkubiert werden. Borrelien-Spirochäten sind anaerob Pflanzen, sind aber in der Natur Schwankungen der Sauerstoff- und Kohlendioxidkonzentration ausgesetzt und reagieren mit Veränderungen der Genexpression26,27,28,29. Daher sollten Genexpressions-, Wachstums- und andere Stoffwechselstudien den Sauerstoff- und Kohlendioxidgehalt mit Hilfe eines sauerstoffkontrollierten Inkubators oder einer anaeroben Kammer kontrollieren. In Kultur werden Kulturen wöchentlich oder häufiger entweder mit Dunkelfeldmikroskopie oder Phasenkontrastmikroskopie auf das Vorhandensein von Spirochäten überprüft. Kulturausstriche können entweder mit Silberfärbungen, Immunhistochemie oder durch die Verwendung fluoreszenzmarkierter Stämme gefärbt werden29,30. Die PCR mit anschließender DNA-Sequenzierung ist eine empfindliche und spezifische Methode zum Nachweis und zur genetischen Identifizierung bzw. Bestätigung der Borrelienspezies 30,31,32,33.

Es gibt viele kleinere Variationen von BSK-II, und einige sind im Handel erhältlich. Das hier in Abschnitt 1 beschriebene Protokoll wurde von Barbour (1984)21 übernommen. Flüssiges MKP-Medium ist ein neueres Medium und wird in Abschnitt 2 beschrieben. Es wird gemäß einem zuvor berichteten Protokoll33,34 hergestellt, das, ähnlich wie BSK-Medium, aus zwei Schritten besteht: der Herstellung des Basismediums und der Herstellung des vollständigen Mediums. Borrelien-Nährmedium kann mit oder ohne Antibiotika hergestellt werden, wie in Abschnitt 3 beschrieben; das Antibiotikagesetz zur Verringerung kontaminierender Bakterien, die bei der Impfung mit klinischen Proben oder Umweltproben eingeführt werden, wie in Abschnitt 4 beschrieben; Bei der Inokulation mit reiner Borrelien-Sp.-Kultur sind möglicherweise keine Antibiotika erforderlich. Es ist oft wichtig, langfristige Borrelienvorräte anzulegen, und ein Protokoll dafür wird in Abschnitt 5 beschrieben. Abschnitt 6 beschreibt die Verwendung dieser Medien zur Isolierung reiner Borrelien-Sensu-Lato-Klone aus klinischen oder Umweltproben. Es gibt eine Reihe möglicher Ansätze36; Im Folgenden finden Sie eine, die sich als wirksam erwiesen hat. Das in diesem Protokoll verwendete Beschichtungsmedium ist eine Modifikation des BSK-II-Beschichtungsmediums37 und des MKP-Mediums34 (wobei das Kaninchenserum auf 10 % erhöht wurde38).

Protocol

Alle Studien mit Proben, die von menschlichen Probanden entnommen wurden, wurden vom Institutional Review Board der jeweiligen Universität und/oder medizinischen Einrichtung genehmigt, und die Teilnehmer wurden vor der Entnahme der Proben eine schriftliche Einverständniserklärung einholen. Alle Studien mit Tierproben wurden genehmigt und nach den Richtlinien der Institutionellen Tierethikkommission durchgeführt. Gegebenenfalls wurden Genehmigungen für Umweltprobenahmen eingeholt. HINWEIS:…

Representative Results

Borrelien-Nährmedien BSK und MKP sowie Varianten sind reichhaltige Nährmedien mit Inhaltsstoffen, die nacheinander vorbereitet und sterilisiert werden müssen. Bei korrekter Zubereitung sollte BSK-Medium rot-orange und klar sein (Abbildung 1). Trübungen und Niederschläge, die nach der Erwärmung bestehen bleiben, deuten auf problematische Inhaltsstoffe, Mediumproduktion oder Kontamination hin. Ein solches Medium wird am besten verworfen. Wenn Gelatine zu BSK und mit MKP hinzugef…

Discussion

Die Laborkultur von Bakterien ist das Sprungbrett für die Forschung. Der tiefgreifende Vorteil, den die Fähigkeit zur Kultivierung mit sich bringt, wird durch den mehr als ein Jahrhundert dauernden Kampf gegen die Kultivierung von Treponema pallidum, der Spirochäte, die der ätiologische Erreger der Syphilis ist, veranschaulicht44. Borrelien-Spirochäten sind auch eine Herausforderung für die Kultur, aber Kultur ist möglich 23,24,34,44,45,46,47,48,49.…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde teilweise vom Natural Science and Engineering Research Council of Canada und der Canadian Lyme Lyme Disease Foundation (AB und VL), dem Schwedischen Forschungsrat (SB, M-LF und IN), TAČR GAMA 2 Projekt – “Unterstützung der Verifizierung des Anwendungspotenzials 2.0 am Biologiezentrum CAS” (TP01010022) (MG und NR) und durch einen Zuschuss des Gesundheitsministeriums der Tschechischen Republik NV19-05-00191 (MG und NR) unterstützt. Wir danken S. Vranjes (2021, AG Rudenko) für das Bild in Abbildung 4 und J. Thomas-Ebbett (2021, AG Lloyd) für die Bilder in Abbildung 5. Wir danken allen Forschern, die zu diesem Gebiet beigetragen haben, und entschuldigen uns bei denen, deren Arbeiten wir aus Platzgründen nicht zitieren konnten.

Materials

1.7 mL tubes VWR 87003-294 Standard item – any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter  VWR 28145-501 Standard item – any supplier will do
10 µL barrier pipette tip Neptune BT10XLS3 Standard item – any supplier will do
10 mL Serological pipettes  Celltreat 229011B Standard item – any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip Neptune BT1000.96 Standard item – any supplier will do
15 mL tube Celltreat 188261 Standard item – any supplier will do
20 µL barrier pipette tip Neptune BT20 Standard item – any supplier will do
20 mL Sterile syringe  BD 309661 Standard item – any supplier will do
200 µL barrier pipette tip Neptune BT200 Standard item – any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes Fisher Scientific 14-933C Standard item – any supplier will do
25 mL Serological pipettes Celltreat 229025B Standard item – any supplier will do
3 mL Sterile syringe BD 309657 Standard item – any supplier will do
35% BSA  Sigma A-7409 Source is important – see note
5 mL Serological pipettes  Celltreat 229006B Standard item – any supplier will do
50 mL tube Celltreat 229421 Standard item – any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes  Schott Schott Nr. 26 135 115 Standard item – any supplier will do
Amikacine Sigma PHR1654 Standard item – any supplier will do
Amphotericin B Sigma A9528-100MG Standard item – any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole Sigma PHR1126-1G Standard item – any supplier will do
BBL Brucella broth  BD 211088 Standard item – any supplier will do
Biosafety Cabinet Labconco 302419100 Standard item – any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top – ACD) Fisher Scientific BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) Standard item – any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]  Darlynn biologicals BB83-500 Standard item – any supplier will do
centrifuge  Eppendorf model 5430 Standard item – any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate Sigma C-8532 100 g Standard item – any supplier will do
CMRL Gibco BRL 21540 500 mL Standard item – any supplier will do
CMRL-1066 Gibco 21-510-018 Standard item – any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene) Fisher Scientific 5000-0020 Standard item – any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm Sigma P7741 Standard item – any supplier will do
Digital Incubator VWR model 1545 Standard item – any supplier will do
DMSO ThermoFisher D12345 Standard item – any supplier will do
Filters for filter sterilization Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane SCGPU05RE Standard item – any supplier will do
Gelatin Difco BD 214340 500 g Standard item – any supplier will do
Glass Culture Tubes Fisher Scientific 99449-20 Standard item – any supplier will do
Glucose Sigma G-7021 1 kg Standard item – any supplier will do
Glycerol Sigma G5516 Standard item – any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) Labwissen Model 3220 Standard item – any supplier will do
HEPES Sigma  H-3784 100 g Standard item – any supplier will do
N-acetylglucoseamine Sigma  A-3286 25 g Standard item – any supplier will do
Neopeptone Difco  BD 211681 500 g Standard item – any supplier will do
Neubauer Hematocytometer Sigma  Z359629 Standard item – any supplier will do
Phase contrast microscope  Leitz Standard item – any supplier will do
Phosphomycin Sigma P5396-1G Standard item – any supplier will do
Phosphomycine Sigma P5396 Standard item – any supplier will do
Pipetboy Integra Standard item – any supplier will do
Precision Standard Balance OHAUS model TS200S Standard item – any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt) Sigma P-8574 25 g Standard item – any supplier will do
Rabbit Serum  Gibco 16-120-032 Source is important 
Rabbit Serum  Sigma R-4505  100 mL Source is important 
Rifampicin Sigma R3501-1G Standard item – any supplier will do
Sodium bicarbonate Sigma S-5761     500 g Standard item – any supplier will do
Sufametaxazole  Sigma PHR1126 Standard item – any supplier will do
TC Yeastolate Difco  BD 255752 100 g Standard item – any supplier will do
Transfer Pipettes VWR 470225-044 Standard item – any supplier will do
Trimethoprim Sigma PHR1056 Standard item – any supplier will do
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References

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Berthold, A., Faucillion, M., Nilsson, I., Golovchenko, M., Lloyd, V., Bergström, S., Rudenko, N. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp. (189), e64431, doi:10.3791/64431 (2022).
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