JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Borrelia burgdorferi Sensu Lato Kompleksi ve Tekrarlayan Ateş Borrelia'dan Spiroketlerin Yetiştirme Yöntemleri

Published: November 25, 2022
doi:
10.3791/64431
, , , , , ,
1Department of Biology,Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology,Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences,Institute of Parasitology

Summary

İn vitro kültür, canlı bakterilerin varlığı için doğrudan bir tespit yöntemidir. Bu protokol, Borrelia burgdorferi sensu lato kompleksi, tekrarlayan ateş Borrelia türleri ve Borrelia miyamotoi dahil olmak üzere çeşitli Borrelia spiroketlerinin kültürü için yöntemleri açıklamaktadır. Bu türler titiz ve yavaş büyür, ancak kültürlenebilir.

Abstract

Borrelia, B. burgdorferi sensu lato (s.l.) olarak da bilinen ve yakın zamanda Borreliella, tekrarlayan ateş (RF) grubu Borrelia ve üçüncü bir sürüngen ilişkili spiroket grubu olarak yeniden sınıflandırılan Lyme borreliosis (LB) grubundan oluşan üç tür grubundan oluşur. Kültüre dayalı yöntemler, hem araştırma hem de klinik çalışmalar için bakteriyel enfeksiyonların laboratuvar tespiti için altın standart olmaya devam etmektedir, çünkü vücut sıvılarından veya dokularından patojenlerin kültürü, çoğalan patojenleri doğrudan tespit eder ve araştırma için kaynak materyal sağlar. Borrelia ve Borreliella spiroketleri titiz ve yavaş büyür ve bu nedenle klinik amaçlar için yaygın olarak kültürlenmezler; Ancak, araştırma için kültür gereklidir. Bu protokol, B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis ve RFspiroketleri, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis ve B. miyamotoi. LB ve RF spiroketlerinin yetiştirilmesi için temel ortam, yerleşik kültürlerde spiroketlerin büyümesini güvenilir bir şekilde destekleyen Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II veya BSK-H) ortamıdır. İnokulumda başlangıç spiroket sayısının düşük olduğu kene veya konakçı kaynaklı örneklerden yeni izole edilmiş Borrelia izolatlarını yetiştirebilmek için, modifiye Kelly-Pettenkofer (MKP) ortamı tercih edilir. Bu ortam aynı zamanda B. miyamotoi’nin büyümesini de destekler.RF spiroketlerin yetiştiriciliğinin başarısı da kritik olarak bileşenlerin kalitesine bağlıdır.

Introduction

Borrelia, üç ana kladeyi kapsayan bir spiroket bakteri cinsidir: Lyme borreliosis (LB) grubu, tekrarlayan ateş (RF) grubu ve görünüşte sürüngenlerle sınırlı olan daha az iyi karakterize edilmiş bir grup. Borrelia taksonomisi, diğer birçok taksonomik grup 1,2,3,4,5,6,7 için geçerli olduğu gibi, genom ve proteom karşılaştırmalarına izin veren moleküler metodolojilerin ortaya çıkmasıyla uyum içindedir. LB grubu (Lyme hastalığı grubu olarak da adlandırılır) geleneksel olarak en iyi karakterize edilen üyesi Borrelia burgdorferi sensu stricto’dan sonra Borrelia burgdorferi sensu lato olarak adlandırılmıştır.  Bu makale şu anda en yaygın kullanılan terminolojiyi kullanmaktadır: LB, RF ve sürüngenle ilişkili grup, LB ve RF grupları için kültür protokollerini açıklamaktadır.

Spirochaetaceae familyasının bir üyesi için beklendiği gibi, Borrelia, tipik olarak 20-30 μm uzunluğunda ve 0.2-0.3 μm genişliğinde, belirgin şekilde uzun ve ince spiral şeklini benimseyebilir. Bununla birlikte, Borrelia hücreleri oldukça pleomorfiktir ve karmaşık hücresel ve genetik yapılarının bir sonucu olarak hem kültürde hem de in vivo 1,8’de birçok başka şekli benimseyebilir. Spiroketal formunda, düzlemsel sinüs dalgası morfolojisi, iç ve dış zarlar arasındaki periplazmik boşlukta dönen eksenel endoflagellasından kaynaklanır. Bu yapı, hücrelerin konakçı dokularla etkileşime girmesini sağlayan proteinler içeren dış zar ile hücrelerin oldukça hareketli olmasını sağlar 9,10. Dış zar proteinlerinin ekspresyonu sıkı bir şekilde düzenlenir ve sadece konakçı doku invazyonunu değil, aynı zamanda konakçı bağışıklık sistemi ile etkileşimi de etkiler11. Bu karmaşık gen ekspresyonu, Borrelia hücrelerinin omurgalı konakçıların ve omurgasız vektörlerin çok farklı ortamları arasında mekik dokumasına izin verir. Borrelia’nın genomu, dairesel bir kromozomdan ziyade doğrusal bir kromozomdan oluşan prokaryotlar arasında olağandışıdır. Doğrusal kromozoma ek olarak, Borrelia türleri bazıları doğrusal ve bazıları dairesel olmak üzere 7-21 plazmid içerir. Plazmidler, konakçı adaptasyonu ve virülans için gerekli genlerin çoğunu barındırır ve profajlardan türetilen dairesel plazmidlerin, spiroketal hücreler arasındaki yatay gen akışının çoğunluğundan sorumlu olduğu düşünülmektedir12,13. Konakçı adaptasyonundaki rolüyle tutarlı olarak, Lyme borreliosis grubunun bazıları, muhtemelen çoğu veya tümü, kültür14’te plazmidleri kaybeder. B. burgdorferi’nin en iyi çalışılmış “laboratuvara uyarlanmış” suşu olan B31, bu türün vahşi izolatlarında bulunan dokuz plazmidden sadece yedisine sahiptir15. Benzer şekilde, B. garinii kültür16’da plazmidleri kaybeder. Bazı çalışmalar, RF türlerinin ve B. miyamotoi’nin kültürlendiğinde plazmidleri koruduğunu göstermiştir14,17, ancak son çalışmalar uzun süreli in vitro ekim ile değişmiş plazmidleri ve bulaşıcılık göstermektedir 18.

Kültüre dayalı yöntemler, hem araştırma hem de klinik çalışmalar için bakteriyel enfeksiyonların laboratuvar tespitinde altın standart olmaya devam etmektedir14,17. Vücut sıvılarından veya dokularından patojenlerin kültürü, çoğalan patojenleri doğrudan tespit eder ve araştırma için kaynak materyal sağlar14,17. Bu protokol, LB grubunun spiroketlerinin yanı sıra RF Borrelia ve B. miyamotoi’nin spiroşetlerini başarılı bir şekilde kültürlemek için gereken metodolojiyi ve tarifleri göstermektedir. Borrelia spiroketlerinin yetiştirilmesi için temel ortam, kirletici prokaryotların büyümesini azaltmak için antibiyotikli veya antibiyotiksiz Barbour-Stoenner-Kelly ortamıdır (BSK-II veya ticari olarak temin edilebilen BSK-H). Bu ortam, başlangıçta RF Borrelia19’u desteklemek için kullanılan bir ortamdan uyarlandı, Stoenner20 ve daha sonra Barbour21 tarafından daha da değiştirildi. O zamandan beri, her biri büyümeyi, bulaşıcılığı ve patojeniteyi etkileyebilecek bakteriyel fizyoloji üzerinde etkileri olan birçok modifikasyon geliştirilmiştir22. Bu ortam, yerleşik kültürlerde spiroketlerin büyümesini güvenilir bir şekilde destekler ve spiroketleri kene, memeli ve klinik örneklerden izole etmek için kullanılmıştır23. Daha yakın zamanda geliştirilen varyasyon, modifiye Kelly-Pettenkofer (MKP) ortamı, yeni Borrelia izolatlarını çevresel örneklerden izole ederken, kültürü tohumlamak için mevcut numunede bulunan spiroket sayısı düşük olduğunda daha iyi izolasyon başarısı, morfoloji ve motilite, 23,24 sağlayabilir. Her durumda, yetiştiriciliğin başarısı kritik olarak taze hazırlanmış ortama ve uygun bileşenlerin kullanımına bağlıdır; Tüm ticari bileşenler yüksek kaliteli ortam üretmez. Aşılanmış kültürler, az miktarda artık ortam oksijeni varlığında geleneksel bir 32-34 ° C inkübatörde sallanmadan rahatça inkübe edilebilir. Borrelia spiroketleri anaeroblardır, ancak doğada oksijen ve karbondioksit konsantrasyonlarındaki dalgalanmalara maruz kalırlar ve gen ekspresyonundaki değişikliklerle yanıt verirler26,27,28,29. Bu nedenle, gen ekspresyonu, büyüme ve diğer metabolik çalışmalar, oksijen kontrollü bir inkübatör veya anaerobik oda kullanılarak oksijen ve karbondioksit seviyelerini kontrol etmelidir. Kültürde, kültürler haftalık olarak veya daha sık, karanlık alan mikroskobu veya faz kontrast mikroskobu ile spiroketlerin varlığı açısından kontrol edilir. Kültür yaymaları gümüş lekeleri, immünohistokimya veya floresan etiketli suşların kullanımı ileboyanabilir 29,30. PCR’yi takiben DNA dizilimi, Borrelia türlerini30,31,32,33 tespit etmek ve genetik olarak tanımlamak veya doğrulamak için hassas ve spesifik bir yöntemdir.

BSK-II üzerinde birçok küçük varyasyon mevcuttur ve bazıları ticari olarak temin edilebilir. Burada bölüm 1’de açıklanan protokol Barbour (1984)21’den uyarlanmıştır. Sıvı MKP ortamı daha yeni geliştirilmiş bir ortamdır ve bölüm 2’de açıklanmıştır. BSK ortamına benzer şekilde iki adımdan oluşan daha önce bildirilen bir protokol33,34’e göre hazırlanır: temel ortamın hazırlanması ve tam ortamın hazırlanması. Borrelia kültür ortamı, bölüm 3’te açıklandığı gibi antibiyotikli veya antibiyotiksiz olarak hazırlanabilir; Antibiyotikler, bölüm 4’te açıklandığı gibi, klinik veya çevresel örneklerle aşılama sırasında ortaya çıkan kirletici bakterileri azaltmak için hareket eder; saf Borrelia sp. kültürü ile aşılanırsa, antibiyotiklere ihtiyaç duyulmayabilir. Uzun vadeli Borrelia stokları yapmak genellikle önemlidir ve bunu yapmak için bir protokol bölüm 5’te açıklanmıştır. Bölüm 6, saf Borrelia sensu lato klonlarını klinik veya çevresel örneklerden izole etmek için bu ortamların kullanılmasını açıklamaktadır. Olası bir dizi yaklaşım vardır36; Aşağıda etkili olduğu tespit edilen bir tanesi verilmiştir. Bu protokolde kullanılan kaplama ortamı, BSK-II kaplama ortamı 37 ve MKP ortamı34’ün bir modifikasyonudur (tavşan serumu% 10’a yükseltilmiş) 38).

Protocol

İnsan deneklerden elde edilen örnekleri içeren tüm çalışmalar, ilgili Üniversite ve/veya tıbbi tesisin Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmış ve örnekler toplanmadan önce katılımcılardan yazılı bilgilendirilmiş onam alınmıştır. Hayvanlardan alınan örnekleri içeren tüm çalışmalar Kurumsal Hayvan Etik Kurulu rehberliğinde onaylanmış ve yürütülmüştür. İlgili olduğunda, çevresel örnekleme için onaylar alınmıştır. NOT: Kültürün başarıs?…

Representative Results

Borrelia kültür ortamı BSK ve MKP ve varyantları, sırayla hazırlanması ve sterilize edilmesi gereken bileşenlere sahip zengin kültür ortamlarıdır. Doğru hazırlandığında, BSK ortamı kırmızı-turuncu ve berrak olmalıdır (Şekil 1). Isınmadan sonra devam eden bulanıklık ve yağış, sorunlu içerikleri, orta üretimi veya kontaminasyonu gösterir; Böyle bir ortam en iyi şekilde atılır. BSK’ya ve MKP’ye jelatin eklenirse, ortam soğutulduğunda jelatinli ola…

Discussion

Bakterilerin laboratuvar kültürü, araştırma için sıçrama tahtasıdır. Kültür yeteneğinin sağladığı derin avantaj, bir yüzyıldan fazla bir süredir ancak son zamanlarda başarı ile sonuçlanan, sifilizin etiyolojik ajanı olan Treponema pallidum’un kültürüne verilen mücadeleyle örneklenmektedir44. Borrelia spiroketleri de kültüre meydan okuyor, ancak kültür mümkün 23,24,34,44,45,46,47,48,49.<s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma kısmen Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendisliği Araştırma Konseyi ve Kanada Lyme hastalığı Vakfı (AB ve VL), İsveç Araştırma Konseyi (SB, M-LF ve IN), TAČR GAMA 2 projesi – “Biyoloji Merkezi CAS’ta uygulama potansiyeli doğrulama 2.0 desteği” (TP01010022) (MG ve NR) ve Çek Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı NV19-05-00191 (MG ve NR) tarafından desteklenmiştir. Şekil 4’teki görüntü için S. Vranjes’e (2021, Rudenko laboratuvarı) ve Şekil 5’teki görüntüler için J. Thomas-Ebbett’e (2021, Lloyd laboratuvarı) teşekkür ederiz. Alanında emeği geçen tüm araştırmacılara teşekkür ediyor, alan kısıtlılığı nedeniyle çalışmalarına atıf yapamadığımız araştırmacılardan özür diliyoruz.

Materials

1.7 mL tubes VWR 87003-294 Standard item – any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter  VWR 28145-501 Standard item – any supplier will do
10 µL barrier pipette tip Neptune BT10XLS3 Standard item – any supplier will do
10 mL Serological pipettes  Celltreat 229011B Standard item – any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip Neptune BT1000.96 Standard item – any supplier will do
15 mL tube Celltreat 188261 Standard item – any supplier will do
20 µL barrier pipette tip Neptune BT20 Standard item – any supplier will do
20 mL Sterile syringe  BD 309661 Standard item – any supplier will do
200 µL barrier pipette tip Neptune BT200 Standard item – any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes Fisher Scientific 14-933C Standard item – any supplier will do
25 mL Serological pipettes Celltreat 229025B Standard item – any supplier will do
3 mL Sterile syringe BD 309657 Standard item – any supplier will do
35% BSA  Sigma A-7409 Source is important – see note
5 mL Serological pipettes  Celltreat 229006B Standard item – any supplier will do
50 mL tube Celltreat 229421 Standard item – any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes  Schott Schott Nr. 26 135 115 Standard item – any supplier will do
Amikacine Sigma PHR1654 Standard item – any supplier will do
Amphotericin B Sigma A9528-100MG Standard item – any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole Sigma PHR1126-1G Standard item – any supplier will do
BBL Brucella broth  BD 211088 Standard item – any supplier will do
Biosafety Cabinet Labconco 302419100 Standard item – any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top – ACD) Fisher Scientific BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) Standard item – any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]  Darlynn biologicals BB83-500 Standard item – any supplier will do
centrifuge  Eppendorf model 5430 Standard item – any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate Sigma C-8532 100 g Standard item – any supplier will do
CMRL Gibco BRL 21540 500 mL Standard item – any supplier will do
CMRL-1066 Gibco 21-510-018 Standard item – any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene) Fisher Scientific 5000-0020 Standard item – any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm Sigma P7741 Standard item – any supplier will do
Digital Incubator VWR model 1545 Standard item – any supplier will do
DMSO ThermoFisher D12345 Standard item – any supplier will do
Filters for filter sterilization Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane SCGPU05RE Standard item – any supplier will do
Gelatin Difco BD 214340 500 g Standard item – any supplier will do
Glass Culture Tubes Fisher Scientific 99449-20 Standard item – any supplier will do
Glucose Sigma G-7021 1 kg Standard item – any supplier will do
Glycerol Sigma G5516 Standard item – any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) Labwissen Model 3220 Standard item – any supplier will do
HEPES Sigma  H-3784 100 g Standard item – any supplier will do
N-acetylglucoseamine Sigma  A-3286 25 g Standard item – any supplier will do
Neopeptone Difco  BD 211681 500 g Standard item – any supplier will do
Neubauer Hematocytometer Sigma  Z359629 Standard item – any supplier will do
Phase contrast microscope  Leitz Standard item – any supplier will do
Phosphomycin Sigma P5396-1G Standard item – any supplier will do
Phosphomycine Sigma P5396 Standard item – any supplier will do
Pipetboy Integra Standard item – any supplier will do
Precision Standard Balance OHAUS model TS200S Standard item – any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt) Sigma P-8574 25 g Standard item – any supplier will do
Rabbit Serum  Gibco 16-120-032 Source is important 
Rabbit Serum  Sigma R-4505  100 mL Source is important 
Rifampicin Sigma R3501-1G Standard item – any supplier will do
Sodium bicarbonate Sigma S-5761     500 g Standard item – any supplier will do
Sufametaxazole  Sigma PHR1126 Standard item – any supplier will do
TC Yeastolate Difco  BD 255752 100 g Standard item – any supplier will do
Transfer Pipettes VWR 470225-044 Standard item – any supplier will do
Trimethoprim Sigma PHR1056 Standard item – any supplier will do
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aberer, E., Duray, P. H. Morphology of Borrelia burgdorferi: Structural patterns of cultured borreliae in relation to staining methods. Journal of Clinical Microbiology. 29 (4), 764-772 (1991).
  2. Estrada-Peña, A., Cabezas-Cruz, A. Phyloproteomic and functional analyses do not support a split in the genus Borrelia (phylum Spirochaetes). BMC Evolutionary Biology. 19 (1), 54 (2019).
  3. Parte, A. C., Carbasse, J. S., Meier-Kolthoff, J. P., Reimer, L. C., Göker, M. List of prokaryotic names with standing in nomenclature (LPSN) moves to the DSMZ. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (11), 5607-5612 (2020).
  4. . List of prokaryotic names with standing in nomenclature Genus Borrelia Available from: https://lpsn.dsmz.de/gnus/borrelia (2022)
  5. Margos, G., et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 13 (12), 0208432 (2018).
  6. Gupta, R. S., et al. Distinction between Borrelia and Borreliella is more robustly supported by molecular and phenotypic characteristics than all other neighbouring prokaryotic genera: Response to Margos’ et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 14 (12), 0221397 (2019).
  7. Barbour, A. G., Qiu, W., Trujillo, S., Dedysh, P., DeVos, B., Hedlund, P., Kampfer, F. A., Rainey, W. B., Whitman, Borreliella. Bergey’s Manual of Systematics of Archaea and Bacteria. , 1-22 (2019).
  8. Rudenko, N., Golovchenko, M., Kybicova, K., Vancova, M. Metamorphoses of Lyme disease spirochetes: Phenomenon of Borrelia persisters. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-10 (2019).
  9. Strnad, M., et al. Nanomechanical mechanisms of Lyme disease spirochete motility enhancement in extracellular matrix. Communications Biology. 4 (1), 268 (2021).
  10. Niddam, A. F., et al. Plasma fibronectin stabilizes Borrelia burgdorferi-endothelial interactions under vascular shear stress by a catch-bond mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (17), 3490-3498 (2017).
  11. Anderson, C., Brissette, C. A. The brilliance of Borrelia: Mechanisms of host immune evasion by Lyme disease-causing Spirochetes. Pathogens. 10 (3), 1-17 (2021).
  12. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
  13. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 409-454 (2021).
  14. Lopez, J. E., et al. Relapsing fever spirochetes retain infectivity after prolonged in vitro cultivation. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 8 (6), 813-820 (2008).
  15. Schwan, T. G., Burgdorfer, W., Garon, C. F. Changes in infectivity and plasmid profile of the Lyme disease spirochete, Borrelia Burgdorferi, as a result of in vitro cultivation. Infection and Immunity. 56 (8), 1831-1836 (1988).
  16. Biškup, U. G., Strle, F., Ružić-Sabljić, E. Loss of plasmids of Borrelia burgdorferi sensu lato during prolonged in vitro cultivation. Plasmid. 66 (1), 1-6 (2011).
  17. Gilmore, R. D., et al. Borrelia miyamotoi strain LB-2001 retains plasmids and infectious phenotype throughout continuous culture passages as evaluated by multiplex PCR. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (1), 101587 (2021).
  18. Krishnavajhala, A., Armstrong, B. A., Lopez, J. E. The impact of in vitro cultivation on the natural life cycle of the tick-borne relapsing fever spirochete Borrelia turicatae. PLoS One. 15 (10), 0239089 (2020).
  19. Kelly, R. Cultivation of Borrelia hermsi. Science. 173 (3995), 443-444 (1971).
  20. Stoenner, H. G. Biology of Borrelia hermsii in Kelly Medium. Applied Microbiology. 28 (4), 540-543 (1974).
  21. Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale Journal of Biology and Medicine. 57 (4), 521-525 (1984).
  22. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  23. Pollack, R. J., Telford, S. R., Spielman, A. Standardization of medium for culturing Lyme disease spirochetes. Journal of Clinical Microbiology. 31 (5), 1251-1255 (1993).
  24. Ružiæ-Sabljiæ, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622 (2017).
  25. Ružić-Sabljić, E., et al. Comparison of isolation rate of Borrelia burgdorferi sensu lato in two different culture media, MKP and BSK-H. Clinical Microbiology and Infection. 20 (7), 636-641 (2014).
  26. Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
  27. Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
  28. Raffel, S. J., Williamson, B. N., Schwan, T. G., Gherardini, F. C. Colony formation in solid medium by the relapsing fever spirochetes Borrelia hermsii and Borrelia turicatae. Ticks and Tick-borne Diseases. 9 (2), 281-287 (2018).
  29. Margos, G., et al. Long-term in vitro cultivation of Borrelia miyamotoi. Ticks and Tick-borne Diseases. 6 (2), 181-184 (2015).
  30. Middelveen, M. J., et al. Culture and identification of Borrelia spirochetes in human vaginal and seminal secretions. F1000Research. 3, 309 (2014).
  31. Moriarty, T. J., et al. Real-time high resolution 3D imaging of the Lyme disease spirochete adhering to and escaping from the vasculature of a living host. PLoS Pathogens. 4 (6), 1000090 (2008).
  32. Cerar, T., Korva, M., Avšič-Županc, T., Ružić-Sabljić, E. Detection, identification and genotyping of Borrellia spp. In rodents in Slovenia by PCR and culture. BMC Veterinary Research. 11, 188 (2015).
  33. Liebisch, G., Sohns, B., Bautsch, W. Detection and typing of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus ticks attached to human skin by PCR. Journal of Clinical Microbiology. 36 (11), 3355-3358 (1998).
  34. Ružić-Sabljić, E., Strle, F. Comparison of growth of Borrelia afzelii, B. gavinii, and B. burgdorferi sense strict in MKP and BSK-II medium. International Journal of Medical Microbiology. 294 (6), 407-412 (2004).
  35. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Schierz, G. European Borrelia burgdorferi isolated from humans and ticks culture conditions and antibiotic susceptibility. Zentralblatt fur Bakteriologie Mikrobiologie und Hygiene. Series A, Medical Microbiology, Infectious Diseases, Virology, Parasitology. 263 (1-2), 112-118 (1986).
  36. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Reinhardt, S. Culture of Borrelia burgdorferi on six solid media. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (12), 1076-1079 (1991).
  37. Rosa, P. A., Hogan, D. Colony formation by Borrelia burgdorferi in solid medium: clonal analysis of osp locus variants. First International Conference on Tick Borne Pathogens at the Host-Vector Interface: An Agenda for Research. , 95-103 (1992).
  38. Wagemakers, A., Oei, A., Fikrig, M. M., Miellet, W. R., Hovius, J. W. The relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi is cultivable in a modified Kelly-Pettenkofer medium, and is resistant to human complement. Parasites and Vectors. 7 (1), 4-9 (2014).
  39. Oliver, J. H., et al. First isolation and cultivation of Borrelia burgdorferi sensu lato from Missouri. Journal of Clinical Microbiology. 36 (1), 1-5 (1998).
  40. Greenfield, E. A. Myeloma and hybridoma cell counts and viability checks. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), 689-690 (2019).
  41. Baradaran-Dilmaghani, R., Stanek, G. In vitro susceptibility of thirty borrelia strains from various sources against eight antimicrobial chemotherapeutics. Infection. 24 (1), 60-63 (1996).
  42. Ružić-Sabljić, E., Podreka, T., Maraspin, V., Strle, F. Susceptibility of Borrelia afzelii strains to antimicrobial agents. International Journal of Antimicrobial Agents. 25 (6), 474-478 (2005).
  43. Sicklinger, M., Wienecke, R., Neubert, U. In vitro susceptibility testing of four antibiotics against Borrelia burgdorferi: A comparison of results for the three genospecies Borrelia afzelii, Borrelia garinii, and Borrelia burgdorferi sensu stricto. Journal of Clinical Microbiology. 41 (4), 1791-1793 (2003).
  44. Edmondson, D. G., Hu, B., Norris, S. J. Long-term in vitro culture of the syphilis spirochete treponema pallidum subsp. Pallidum. mBio. 9 (3), 01153 (2018).
  45. Wilhelmsson, P., et al. Prevalence and diversity of Borrelia species in ticks that have bitten humans in Sweden. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 4169-4176 (2010).
  46. Toledo, A., et al. Phylogenetic analysis of a virulent Borrelia species isolated from patients with relapsing fever. Journal of Clinical Microbiology. 48 (7), 2484-2489 (2010).
  47. Elbir, H., et al. Genome sequence of the Asiatic species Borrelia persica. Genome Announcements. 2 (1), 01127 (2014).
  48. Sapi, E., et al. Improved culture conditions for the growth and detection of Borrelia from human serum. International Journal of Medical Sciences. 10 (4), 362-376 (2013).
  49. Liveris, D., et al. Quantitative detection of Borrelia burgdorferi in 2-millimeter skin samples of erythema migrans lesions: Correlation of results with clinical and laboratory findings. Journal of Clinical Microbiology. 40 (4), 1249-1253 (2002).
  50. Wormser, G. P., et al. Comparison of the yields of blood cultures using serum or plasma from patients with early Lyme disease. Journal of Clinical Microbiology. 38 (4), 1648-1650 (2000).
  51. Lagal, V., Postic, D., Ruzic-Sabljic, E., Baranton, G. Genetic diversity among Borrelia strains determined by single-strand conformation polymorphism analysis of the ospC gene and its association with invasiveness. Journal of Clinical Microbiology. 41 (11), 5059-5065 (2003).
  52. Lin, Y. P., Diuk-Wasser, M. A., Stevenson, B., Kraiczy, P. Complement evasion contributes to Lyme Borreliae-host associations. Trends in Parasitology. 36 (7), 634-645 (2020).
  53. Real-time PCR: understanding Ct. Application Note Real-time PCR. Thermo Fisher Scientific Inc Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/PG1503-PJ9169-CO019879-Re-brand-Real-Time-PCR-Undertanding-Ct-Value-Americas-FHR.pdf (2016)
  54. Adams, B., Walter, K. S., Diuk-Wasser, M. A. Host specialisation, immune cross-reaction and the composition of communities of co-circulating Borrelia strains. Bulletin of Mathematical Biology. 83 (6), 66 (2021).
  55. Marosevic, D., et al. First insights in the variability of Borrelia recurrentis genomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (9), 0005865 (2017).
  56. Koetsveld, J., et al. Development and optimization of an in vitro cultivation protocol allows for isolation of Borrelia miyamotoi from patients with hard tick-borne relapsing fever. Clinical Microbiology and Infection. 23 (7), 480-484 (2017).
  57. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16 (2020).
  58. Replogle, A. J., et al. Isolation of Borrelia miyamotoi and other Borreliae using a modified BSK medium. Scientific Reports. 11 (1), 1926 (2021).
  59. Stanek, G., Reiter, M. The expanding Lyme Borrelia complex-clinical significance of genomic species. Clinical Microbiology and Infection. 17 (4), 487-493 (2011).
  60. Seifert, S. N., Khatchikian, C. E., Zhou, W., Brisson, D. Evolution and population genomics of the Lyme borreliosis pathogen, Borrelia burgdorferi. Trends in Genetics. 31 (4), 201-207 (2015).
  61. Kurokawa, C., et al. Interactions between Borrelia burgdorferi and ticks. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 587-600 (2020).
  62. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 473-518 (2021).
  63. Wolcott, K. A., Margos, G., Fingerle, V., Becker, N. S. Host association of Borrelia burgdorferi sensu lato: A review. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (5), 101766 (2021).
  64. Thompson, D., Watt, J. A., Brissette, C. A. Host transcriptome response to Borrelia burgdorferi sensu lato. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (2), 101638 (2021).
  65. Chaconas, G., Moriarty, T. J., Skare, J., Hyde, J. A. Live imaging. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 385-408 (2021).
  66. Kerstholt, M., Netea, M. G., Joosten, L. A. B. Borrelia burgdorferi hijacks cellular metabolism of immune cells: Consequences for host defense. Ticks and Tick-borne Diseases. 11 (3), 101386 (2020).
  67. Rudenko, N., Golovchenko, M. Sexual transmission of Lyme Borreliosis? The question that calls for an answer. Tropical Medicine and Infectious Disease. 6 (2), 87 (2021).
  68. Cutler, S. J., et al. Diagnosing Borreliosis. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 17 (1), 2-11 (2017).
  69. Middelveen, M. J., et al. Persistent Borrelia infection in patients with ongoing symptoms of Lyme disease. Healthcare. 6 (2), 33 (2018).
  70. Bernard, Q., Grillon, A., Lenormand, C., Ehret-Sabatier, L., Boulanger, N. Skin Interface, a key player for Borrelia multiplication and persistence in Lyme Borreliosis. Trends in Parasitology. 36 (3), 304-314 (2020).
  71. Bobe, J. R., et al. Recent progress in Lyme disease and remaining challenges. Frontiers in Medicine. 8, 666554 (2021).
  72. Branda, J. A., Steere, A. C. Laboratory diagnosis of lyme borreliosis. Clinical Microbiology Reviews. 34 (2), 1-45 (2021).

Tags

SpirochetesBorrelia BurgdorferiRelapsing Fever BorreliaBorrelia MiyamotoiCultureBSK-II MediumBacterial GrowthRabbit SerumGelatinAnaerobic AtmosphereIncubation Temperature

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Berthold, A., Faucillion, M., Nilsson, I., Golovchenko, M., Lloyd, V., Bergström, S., Rudenko, N. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp. (189), e64431, doi:10.3791/64431 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image