JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

طرق زراعة اللولبيات من مجمع بوريليا بورغدورفيري سينسو لاتو وحمى الانتكاس بوريليا

Published: November 25, 2022
doi:
10.3791/64431
, , , , , ,
1Department of Biology,Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology,Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences,Institute of Parasitology

Summary

الثقافة في المختبر هي طريقة للكشف المباشر عن وجود البكتيريا الحية. يصف هذا البروتوكول طرق استزراع اللولبيات البوريليا المتنوعة، بما في ذلك تلك الخاصة بمجمع بوريليا بورغدورفيري بالمعنى الواسع للكلمة، وأنواع بوريليا الحمى الانتكاسية، وبوريليا مياموتوي. هذه الأنواع سريعة وبطيئة النمو ولكن يمكن استزراعها.

Abstract

يتكون Borrelia من ثلاث مجموعات من الأنواع ، تلك الخاصة بمجموعة Lyme borreliosis (LB) ، والمعروفة أيضا باسم B. burgdorferi sensu lato (s.l.) وأعيد تصنيفها مؤخرا إلى Borreliella ، ومجموعة الحمى الانتكاسية (RF) Borrelia ، ومجموعة ثالثة مرتبطة بالزواحف من اللولبيات. تظل الأساليب القائمة على الثقافة هي المعيار الذهبي للكشف المختبري عن الالتهابات البكتيرية لكل من البحث والعمل السريري ، حيث أن زراعة مسببات الأمراض من سوائل أو أنسجة الجسم تكتشف مباشرة تكاثر مسببات الأمراض وتوفر مادة مصدر للبحث. Borrelia و Borreliella spirochetes هي سريعة وبطيئة النمو ، وبالتالي لا يتم استزراعها عادة للأغراض السريرية. ومع ذلك ، فإن الثقافة ضرورية للبحث. يوضح هذا البروتوكول المنهجية والوصفات المطلوبة للنجاح في استزراع اللولبيات LB و RF ، بما في ذلك جميع الأنواع المعترف بها من مجمع B. burgdorferi s.l. بما في ذلك B. afzelii ، B. americana ، B. andersonii ، B. bavariensis ، B. bissettii / bissettiae ، B. burgdorferi sensu stricto (s.s.) ، B. californiensis ، B. carolinensis ، B. chilensis ، B. finlandensis ، B. garinii ، B. japonica ، B. kurtenbachii ، B. lanei ، B. lusitaniae ، B. maritima، B. mayonii، B. spielmanii، B. tanukii، B. turdi، B. sinica، B. valaisiana، B. yangtzensis، و RFspirochetes، B. anserina، B. coriaceae، B. crocidurae، B. duttonii، B. hermsii، B. hispanica، B. persica، B. recurrentis، و B. miyamotoi. الوسيلة الأساسية لزراعة اللولبيات LB و RF هي وسط Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II أو BSK-H) ، والذي يدعم بشكل موثوق نمو اللولبيات في الثقافات الراسخة. لتكون قادرة على زراعة عزلات بوريليا المعزولة حديثا من العينات المشتقة من القراد أو المضيف حيث يكون عدد spirochete الأولي منخفضا في اللقاح ، يفضل استخدام وسط Kelly-Pettenkofer المعدل (MKP). تدعم هذه الوسيلة أيضا نمو B. miyamotoi. يعتمد نجاح زراعة اللولبيات RF أيضا بشكل حاسم على جودة المكونات.

Introduction

Borrelia هو جنس من البكتيريا spirochete التي تشمل ثلاث مجموعات رئيسية: مجموعة Lyme borreliosis (LB) ، ومجموعة الحمى الانتكاسية (RF) ، ومجموعة أقل تميزا على ما يبدو تقتصر على الزواحف. تصنيف بوريليا في حالة تغير مستمر مع ظهور المنهجيات الجزيئية التي تسمح بمقارنات الجينوم والبروتين ، كما هو الحال في معظم المجموعات التصنيفية الأخرى1،2،3،4،5،6،7. يطلق على مجموعة LB (وتسمى أيضا مجموعة مرض لايم) تقليديا اسم Borrelia burgdorferi sensu lato بعد عضوها الأفضل تميزا Borrelia burgdorferi بالمعنى الضيق. تستخدم هذه الورقة المصطلحات الأكثر استخداما حاليا: LB و RF والمجموعة المرتبطة بالزواحف ، وتصف بروتوكولات الاستزراع لمجموعات LB و RF.

كما هو متوقع لأحد أفراد عائلة Spirochaetaceae ، يمكن أن تتبنى Borrelia الشكل الحلزوني الطويل والرقيق المميز ، وعادة ما يكون طوله 20-30 ميكرومتر وعرضه 0.2-0.3 ميكرومتر. ومع ذلك ، فإن خلايا Borrelia متعددة الأشكال للغاية ويمكن أن تتبنى العديد من الأشكال الأخرى في كل من الثقافة وفي الجسم الحي 1,8 نتيجة لتركيبها الخلوي والجيني المعقد. في شكله اللولبسي ، ينتج مورفولوجيا الموجة الجيبية المستوية عن دوران السوط الداخلي المحوري في الفضاء المحيطي بين الأغشية الداخلية والخارجية. يتيح هذا الهيكل للخلايا أن تكون شديدة الحركة ، حيث يحتوي الغشاء الخارجي على بروتينات تمكن الخلية من التفاعل مع الأنسجة المضيفة 9,10. يتم تنظيم التعبير عن بروتينات الغشاء الخارجي بإحكام ولا يؤثر فقط على غزو أنسجة المضيف ولكن أيضا على التفاعل مع الجهاز المناعي المضيف11. يسمح هذا التعبير الجيني المعقد لخلايا بوريليا بالتنقل بين البيئات المختلفة جدا لمضيفات الفقاريات ونواقل اللافقاريات. جينوم بوريليا غير عادي بين بدائيات النوى ، ويتكون من كروموسوم خطي وليس دائري. بالإضافة إلى الكروموسوم الخطي ، تحتوي أنواع Borrelia على 7-21 بلازميدات ، بعضها خطي وبعضها دائري. تحتوي البلازميدات على غالبية الجينات اللازمة لتكيف المضيف وضراوته ، ويعتقد أن البلازميدات الدائرية المشتقة من النبوءات مسؤولة عن غالبية تدفق الجينات الأفقي بين الخلايا اللولبية12,13. تمشيا مع دور في تكيف المضيف ، يفقد بعض ، وربما العديد أو كل ، أعضاء مجموعة Lyme borreliosis البلازميدات في الثقافة14. تحتوي أفضل سلالة “متكيفة مختبريا” تمت دراستها من B. burgdorferi ، B31 ، على سبعة فقط من البلازميدات التسعة الموجودة في العزلات البرية لهذا النوع15. وبالمثل ، يفقد B. garinii البلازميدات في الثقافة16. أظهرت بعض الدراسات أن أنواع RF و B. miyamotoi تحتفظ بالبلازميدات عند استزراعها 14،17 ، لكن العمل الحديث يوضح تغير البلازميدات والعدوى مع الزراعة المختبرية طويلة الأجل18.

تظل الطرق القائمة على الثقافة هي المعيار الذهبي للكشف المختبري عن الالتهابات البكتيرية ، لكل من البحث والعمل السريري14,17. تكتشف ثقافة مسببات الأمراض من سوائل أو أنسجة الجسم بشكل مباشر تكاثر مسببات الأمراض وتوفر مادة مصدر للبحث14,17. يوضح هذا البروتوكول المنهجية والوصفات المطلوبة لاستزراع اللولبيات بنجاح لمجموعة LB وكذلك RF Borrelia و B. miyamotoi. الوسيلة الأساسية لزراعة اللولبيات Borrelia هي وسط Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II أو BSK-H المتاح تجاريا) ، مع أو بدون مضادات حيوية لتقليل نمو بدائيات النوى الملوثة. تم تكييف هذه الوسيلة من وسيط يستخدم في الأصل لدعم RF Borrelia19 ، وتم تعديله بواسطة Stoenner20 ثم بواسطة Barbour21. تم تطوير العديد من التعديلات منذ ذلك الحين ، ولكل منها تأثيرات على فسيولوجيا البكتيريا التي يمكن أن تؤثر على النمو والعدوى والإمراضية22. تدعم هذه الوسيلة بشكل موثوق نمو اللولبيات في الثقافات الراسخة وقد استخدمت لعزل اللولبيات من القراد والثدييات والعينات السريرية23. يمكن أن يوفر الشكل الذي تم تطويره مؤخرا ، وهو وسيط Kelly-Pettenkofer (MKP) المعدل ، نجاحا أفضل في العزل ، والتشكل ، والحركة عند عزل عزلات Borrelia الجديدة من العينات البيئية ، عندما يكون عدد اللولبيات الموجودة في العينة المتاحة لبذر الثقافة منخفضا23,24. وفي جميع الحالات، يعتمد نجاح الزراعة بشكل حاسم على الوسط الطازج واستخدام المكونات المناسبة؛ لا تنتج جميع المكونات التجارية وسطا عالي الجودة. يمكن تحضين المزارع الملقحة بسهولة دون اهتزازها في حاضنة تقليدية 32-34 درجة مئوية في وجود كمية صغيرة من الأكسجين المحيط المتبقي. Borrelia spirochetes هي لاهوائية ولكنها تتعرض بطبيعتها لتقلبات في تركيزات الأكسجين وثاني أكسيد الكربون وتستجيب للتغيرات في التعبير الجيني26،27،28،29. وبالتالي ، يجب أن يتحكم التعبير الجيني والنمو والدراسات الأيضية الأخرى في مستويات الأكسجين وثاني أكسيد الكربون باستخدام حاضنة يتحكم فيها الأكسجين أو غرفة لاهوائية. في الثقافة ، يتم فحص الثقافات أسبوعيا ، أو في كثير من الأحيان ، بحثا عن وجود اللولبيات إما باستخدام المجهر المظلم أو الفحص المجهري لتباين الطور. يمكن تلطيخ مسحات الثقافة إما بالبقع الفضية أو الكيمياء الهيستولوجية المناعية أو من خلال استخدام سلالات موسومة بالفلورسنت29,30. PCR متبوعا بتسلسل الحمض النووي هو طريقة حساسة ومحددة للكشف عن أنواع Borrelia 30،31،32،33 وتحديدها وراثيا أو تأكيدها.

توجد العديد من الاختلافات الطفيفة على BSK-II ، وبعضها متاح تجاريا. تم تكييف البروتوكول الموصوف هنا في القسم 1 من Barbour (1984)21. وسيط MKP السائل هو وسيط تم تطويره مؤخرا ويتم وصفه في القسم 2. يتم إعداده وفقا للبروتوكول33,34 الذي تم الإبلاغ عنه سابقا ، والذي يتكون ، على غرار وسيط BSK ، من خطوتين: إعداد الوسيط الأساسي وإعداد الوسط الكامل. يمكن تحضير وسط استزراع البوريليا بالمضادات الحيوية أو بدونها ، كما هو موضح في القسم 3 ؛ تعمل المضادات الحيوية على الحد من البكتيريا الملوثة التي يتم إدخالها عند التلقيح بعينات سريرية أو بيئية ، كما هو موضح في القسم 4 ؛ في حالة التلقيح باستخدام ثقافة Borrelia sp. النقية ، قد لا تكون هناك حاجة إلى المضادات الحيوية. غالبا ما يكون صنع أسهم Borrelia طويلة الأجل أمرا مهما ، ويتم وصف بروتوكول للقيام بذلك في القسم 5. يصف القسم 6 استخدام هذه الوسائط لعزل استنساخ Borrelia sensu lato النقي من العينات السريرية أو البيئية. هناك عدد من النهج الممكنة36 ؛ أدناه هو واحد وجد أن تكون فعالة. وسيط الطلاء المستخدم في هذا البروتوكول هو تعديل لوسط الطلاء BSK-II37 و MKPالمتوسط 34 (مع زيادة مصل الأرانب إلى 10٪ 38).

Protocol

تمت الموافقة على جميع الدراسات التي تنطوي على عينات تم الحصول عليها من موضوع بشري من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة و / أو المرفق الطبي ذي الصلة ، وتم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المشاركين قبل جمع العينات. تمت الموافقة على جميع الدراسات التي تنطوي على عينات تم الحصول عليها من الح?…

Representative Results

وسائط ثقافة Borrelia BSK و MKP ، والمتغيرات ، هي وسائط ثقافة غنية بالمكونات التي تحتاج إلى التحضير والتعقيم بالتتابع. عند تحضيره بشكل صحيح ، يجب أن يكون وسيط BSK أحمر برتقالي وواضح (الشكل 1). تشير العكارة وهطول الأمطار التي تستمر بعد الاحترار إلى مكونات إشكالية أو إنتاج متوسط أو…

Discussion

الثقافة المختبرية للبكتيريا هي نقطة انطلاق للبحث. تتجسد الميزة العميقة التي تمنحها القدرة على الثقافة في النضال ، على مدى أكثر من قرن من الزمان الذي بلغ ذروته مؤخرا في النجاح ، لثقافة اللولبية الشاحبة ، اللولبية التي هي العامل المسبب لمرض الزهري44. تشكل اللولبيات Borrelia</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا والمؤسسة الكندية لمرض لايم (AB و VL) ، ومجلس البحوث السويدي (SB ، M-LF و IN) ، ومشروع TAČR GAMA 2 – “دعم التحقق من إمكانات التطبيق 2.0 في مركز البيولوجيا CAS” (TP01010022) (MG و NR) ، وبمنحة من وزارة الصحة في الجمهورية التشيكية NV19-05-00191 (MG و NR). نشكر S. Vranjes (2021 ، مختبر Rudenko) على الصورة في الشكل 4 و J. Thomas-Ebbett (2021 ، مختبر لويد) على الصور في الشكل 5. نشكر جميع الباحثين الذين ساهموا في هذا المجال ونعتذر لأولئك الذين لم نتمكن من الاستشهاد بعملهم بسبب قيود المساحة.

Materials

1.7 mL tubes VWR 87003-294 Standard item – any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter  VWR 28145-501 Standard item – any supplier will do
10 µL barrier pipette tip Neptune BT10XLS3 Standard item – any supplier will do
10 mL Serological pipettes  Celltreat 229011B Standard item – any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip Neptune BT1000.96 Standard item – any supplier will do
15 mL tube Celltreat 188261 Standard item – any supplier will do
20 µL barrier pipette tip Neptune BT20 Standard item – any supplier will do
20 mL Sterile syringe  BD 309661 Standard item – any supplier will do
200 µL barrier pipette tip Neptune BT200 Standard item – any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes Fisher Scientific 14-933C Standard item – any supplier will do
25 mL Serological pipettes Celltreat 229025B Standard item – any supplier will do
3 mL Sterile syringe BD 309657 Standard item – any supplier will do
35% BSA  Sigma A-7409 Source is important – see note
5 mL Serological pipettes  Celltreat 229006B Standard item – any supplier will do
50 mL tube Celltreat 229421 Standard item – any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes  Schott Schott Nr. 26 135 115 Standard item – any supplier will do
Amikacine Sigma PHR1654 Standard item – any supplier will do
Amphotericin B Sigma A9528-100MG Standard item – any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole Sigma PHR1126-1G Standard item – any supplier will do
BBL Brucella broth  BD 211088 Standard item – any supplier will do
Biosafety Cabinet Labconco 302419100 Standard item – any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top – ACD) Fisher Scientific BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) Standard item – any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]  Darlynn biologicals BB83-500 Standard item – any supplier will do
centrifuge  Eppendorf model 5430 Standard item – any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate Sigma C-8532 100 g Standard item – any supplier will do
CMRL Gibco BRL 21540 500 mL Standard item – any supplier will do
CMRL-1066 Gibco 21-510-018 Standard item – any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene) Fisher Scientific 5000-0020 Standard item – any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm Sigma P7741 Standard item – any supplier will do
Digital Incubator VWR model 1545 Standard item – any supplier will do
DMSO ThermoFisher D12345 Standard item – any supplier will do
Filters for filter sterilization Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane SCGPU05RE Standard item – any supplier will do
Gelatin Difco BD 214340 500 g Standard item – any supplier will do
Glass Culture Tubes Fisher Scientific 99449-20 Standard item – any supplier will do
Glucose Sigma G-7021 1 kg Standard item – any supplier will do
Glycerol Sigma G5516 Standard item – any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) Labwissen Model 3220 Standard item – any supplier will do
HEPES Sigma  H-3784 100 g Standard item – any supplier will do
N-acetylglucoseamine Sigma  A-3286 25 g Standard item – any supplier will do
Neopeptone Difco  BD 211681 500 g Standard item – any supplier will do
Neubauer Hematocytometer Sigma  Z359629 Standard item – any supplier will do
Phase contrast microscope  Leitz Standard item – any supplier will do
Phosphomycin Sigma P5396-1G Standard item – any supplier will do
Phosphomycine Sigma P5396 Standard item – any supplier will do
Pipetboy Integra Standard item – any supplier will do
Precision Standard Balance OHAUS model TS200S Standard item – any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt) Sigma P-8574 25 g Standard item – any supplier will do
Rabbit Serum  Gibco 16-120-032 Source is important 
Rabbit Serum  Sigma R-4505  100 mL Source is important 
Rifampicin Sigma R3501-1G Standard item – any supplier will do
Sodium bicarbonate Sigma S-5761     500 g Standard item – any supplier will do
Sufametaxazole  Sigma PHR1126 Standard item – any supplier will do
TC Yeastolate Difco  BD 255752 100 g Standard item – any supplier will do
Transfer Pipettes VWR 470225-044 Standard item – any supplier will do
Trimethoprim Sigma PHR1056 Standard item – any supplier will do
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aberer, E., Duray, P. H. Morphology of Borrelia burgdorferi: Structural patterns of cultured borreliae in relation to staining methods. Journal of Clinical Microbiology. 29 (4), 764-772 (1991).
  2. Estrada-Peña, A., Cabezas-Cruz, A. Phyloproteomic and functional analyses do not support a split in the genus Borrelia (phylum Spirochaetes). BMC Evolutionary Biology. 19 (1), 54 (2019).
  3. Parte, A. C., Carbasse, J. S., Meier-Kolthoff, J. P., Reimer, L. C., Göker, M. List of prokaryotic names with standing in nomenclature (LPSN) moves to the DSMZ. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (11), 5607-5612 (2020).
  4. . List of prokaryotic names with standing in nomenclature Genus Borrelia Available from: https://lpsn.dsmz.de/gnus/borrelia (2022)
  5. Margos, G., et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 13 (12), 0208432 (2018).
  6. Gupta, R. S., et al. Distinction between Borrelia and Borreliella is more robustly supported by molecular and phenotypic characteristics than all other neighbouring prokaryotic genera: Response to Margos’ et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 14 (12), 0221397 (2019).
  7. Barbour, A. G., Qiu, W., Trujillo, S., Dedysh, P., DeVos, B., Hedlund, P., Kampfer, F. A., Rainey, W. B., Whitman, Borreliella. Bergey’s Manual of Systematics of Archaea and Bacteria. , 1-22 (2019).
  8. Rudenko, N., Golovchenko, M., Kybicova, K., Vancova, M. Metamorphoses of Lyme disease spirochetes: Phenomenon of Borrelia persisters. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-10 (2019).
  9. Strnad, M., et al. Nanomechanical mechanisms of Lyme disease spirochete motility enhancement in extracellular matrix. Communications Biology. 4 (1), 268 (2021).
  10. Niddam, A. F., et al. Plasma fibronectin stabilizes Borrelia burgdorferi-endothelial interactions under vascular shear stress by a catch-bond mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (17), 3490-3498 (2017).
  11. Anderson, C., Brissette, C. A. The brilliance of Borrelia: Mechanisms of host immune evasion by Lyme disease-causing Spirochetes. Pathogens. 10 (3), 1-17 (2021).
  12. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
  13. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 409-454 (2021).
  14. Lopez, J. E., et al. Relapsing fever spirochetes retain infectivity after prolonged in vitro cultivation. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 8 (6), 813-820 (2008).
  15. Schwan, T. G., Burgdorfer, W., Garon, C. F. Changes in infectivity and plasmid profile of the Lyme disease spirochete, Borrelia Burgdorferi, as a result of in vitro cultivation. Infection and Immunity. 56 (8), 1831-1836 (1988).
  16. Biškup, U. G., Strle, F., Ružić-Sabljić, E. Loss of plasmids of Borrelia burgdorferi sensu lato during prolonged in vitro cultivation. Plasmid. 66 (1), 1-6 (2011).
  17. Gilmore, R. D., et al. Borrelia miyamotoi strain LB-2001 retains plasmids and infectious phenotype throughout continuous culture passages as evaluated by multiplex PCR. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (1), 101587 (2021).
  18. Krishnavajhala, A., Armstrong, B. A., Lopez, J. E. The impact of in vitro cultivation on the natural life cycle of the tick-borne relapsing fever spirochete Borrelia turicatae. PLoS One. 15 (10), 0239089 (2020).
  19. Kelly, R. Cultivation of Borrelia hermsi. Science. 173 (3995), 443-444 (1971).
  20. Stoenner, H. G. Biology of Borrelia hermsii in Kelly Medium. Applied Microbiology. 28 (4), 540-543 (1974).
  21. Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale Journal of Biology and Medicine. 57 (4), 521-525 (1984).
  22. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  23. Pollack, R. J., Telford, S. R., Spielman, A. Standardization of medium for culturing Lyme disease spirochetes. Journal of Clinical Microbiology. 31 (5), 1251-1255 (1993).
  24. Ružiæ-Sabljiæ, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622 (2017).
  25. Ružić-Sabljić, E., et al. Comparison of isolation rate of Borrelia burgdorferi sensu lato in two different culture media, MKP and BSK-H. Clinical Microbiology and Infection. 20 (7), 636-641 (2014).
  26. Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
  27. Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
  28. Raffel, S. J., Williamson, B. N., Schwan, T. G., Gherardini, F. C. Colony formation in solid medium by the relapsing fever spirochetes Borrelia hermsii and Borrelia turicatae. Ticks and Tick-borne Diseases. 9 (2), 281-287 (2018).
  29. Margos, G., et al. Long-term in vitro cultivation of Borrelia miyamotoi. Ticks and Tick-borne Diseases. 6 (2), 181-184 (2015).
  30. Middelveen, M. J., et al. Culture and identification of Borrelia spirochetes in human vaginal and seminal secretions. F1000Research. 3, 309 (2014).
  31. Moriarty, T. J., et al. Real-time high resolution 3D imaging of the Lyme disease spirochete adhering to and escaping from the vasculature of a living host. PLoS Pathogens. 4 (6), 1000090 (2008).
  32. Cerar, T., Korva, M., Avšič-Županc, T., Ružić-Sabljić, E. Detection, identification and genotyping of Borrellia spp. In rodents in Slovenia by PCR and culture. BMC Veterinary Research. 11, 188 (2015).
  33. Liebisch, G., Sohns, B., Bautsch, W. Detection and typing of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus ticks attached to human skin by PCR. Journal of Clinical Microbiology. 36 (11), 3355-3358 (1998).
  34. Ružić-Sabljić, E., Strle, F. Comparison of growth of Borrelia afzelii, B. gavinii, and B. burgdorferi sense strict in MKP and BSK-II medium. International Journal of Medical Microbiology. 294 (6), 407-412 (2004).
  35. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Schierz, G. European Borrelia burgdorferi isolated from humans and ticks culture conditions and antibiotic susceptibility. Zentralblatt fur Bakteriologie Mikrobiologie und Hygiene. Series A, Medical Microbiology, Infectious Diseases, Virology, Parasitology. 263 (1-2), 112-118 (1986).
  36. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Reinhardt, S. Culture of Borrelia burgdorferi on six solid media. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (12), 1076-1079 (1991).
  37. Rosa, P. A., Hogan, D. Colony formation by Borrelia burgdorferi in solid medium: clonal analysis of osp locus variants. First International Conference on Tick Borne Pathogens at the Host-Vector Interface: An Agenda for Research. , 95-103 (1992).
  38. Wagemakers, A., Oei, A., Fikrig, M. M., Miellet, W. R., Hovius, J. W. The relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi is cultivable in a modified Kelly-Pettenkofer medium, and is resistant to human complement. Parasites and Vectors. 7 (1), 4-9 (2014).
  39. Oliver, J. H., et al. First isolation and cultivation of Borrelia burgdorferi sensu lato from Missouri. Journal of Clinical Microbiology. 36 (1), 1-5 (1998).
  40. Greenfield, E. A. Myeloma and hybridoma cell counts and viability checks. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), 689-690 (2019).
  41. Baradaran-Dilmaghani, R., Stanek, G. In vitro susceptibility of thirty borrelia strains from various sources against eight antimicrobial chemotherapeutics. Infection. 24 (1), 60-63 (1996).
  42. Ružić-Sabljić, E., Podreka, T., Maraspin, V., Strle, F. Susceptibility of Borrelia afzelii strains to antimicrobial agents. International Journal of Antimicrobial Agents. 25 (6), 474-478 (2005).
  43. Sicklinger, M., Wienecke, R., Neubert, U. In vitro susceptibility testing of four antibiotics against Borrelia burgdorferi: A comparison of results for the three genospecies Borrelia afzelii, Borrelia garinii, and Borrelia burgdorferi sensu stricto. Journal of Clinical Microbiology. 41 (4), 1791-1793 (2003).
  44. Edmondson, D. G., Hu, B., Norris, S. J. Long-term in vitro culture of the syphilis spirochete treponema pallidum subsp. Pallidum. mBio. 9 (3), 01153 (2018).
  45. Wilhelmsson, P., et al. Prevalence and diversity of Borrelia species in ticks that have bitten humans in Sweden. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 4169-4176 (2010).
  46. Toledo, A., et al. Phylogenetic analysis of a virulent Borrelia species isolated from patients with relapsing fever. Journal of Clinical Microbiology. 48 (7), 2484-2489 (2010).
  47. Elbir, H., et al. Genome sequence of the Asiatic species Borrelia persica. Genome Announcements. 2 (1), 01127 (2014).
  48. Sapi, E., et al. Improved culture conditions for the growth and detection of Borrelia from human serum. International Journal of Medical Sciences. 10 (4), 362-376 (2013).
  49. Liveris, D., et al. Quantitative detection of Borrelia burgdorferi in 2-millimeter skin samples of erythema migrans lesions: Correlation of results with clinical and laboratory findings. Journal of Clinical Microbiology. 40 (4), 1249-1253 (2002).
  50. Wormser, G. P., et al. Comparison of the yields of blood cultures using serum or plasma from patients with early Lyme disease. Journal of Clinical Microbiology. 38 (4), 1648-1650 (2000).
  51. Lagal, V., Postic, D., Ruzic-Sabljic, E., Baranton, G. Genetic diversity among Borrelia strains determined by single-strand conformation polymorphism analysis of the ospC gene and its association with invasiveness. Journal of Clinical Microbiology. 41 (11), 5059-5065 (2003).
  52. Lin, Y. P., Diuk-Wasser, M. A., Stevenson, B., Kraiczy, P. Complement evasion contributes to Lyme Borreliae-host associations. Trends in Parasitology. 36 (7), 634-645 (2020).
  53. Real-time PCR: understanding Ct. Application Note Real-time PCR. Thermo Fisher Scientific Inc Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/PG1503-PJ9169-CO019879-Re-brand-Real-Time-PCR-Undertanding-Ct-Value-Americas-FHR.pdf (2016)
  54. Adams, B., Walter, K. S., Diuk-Wasser, M. A. Host specialisation, immune cross-reaction and the composition of communities of co-circulating Borrelia strains. Bulletin of Mathematical Biology. 83 (6), 66 (2021).
  55. Marosevic, D., et al. First insights in the variability of Borrelia recurrentis genomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (9), 0005865 (2017).
  56. Koetsveld, J., et al. Development and optimization of an in vitro cultivation protocol allows for isolation of Borrelia miyamotoi from patients with hard tick-borne relapsing fever. Clinical Microbiology and Infection. 23 (7), 480-484 (2017).
  57. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16 (2020).
  58. Replogle, A. J., et al. Isolation of Borrelia miyamotoi and other Borreliae using a modified BSK medium. Scientific Reports. 11 (1), 1926 (2021).
  59. Stanek, G., Reiter, M. The expanding Lyme Borrelia complex-clinical significance of genomic species. Clinical Microbiology and Infection. 17 (4), 487-493 (2011).
  60. Seifert, S. N., Khatchikian, C. E., Zhou, W., Brisson, D. Evolution and population genomics of the Lyme borreliosis pathogen, Borrelia burgdorferi. Trends in Genetics. 31 (4), 201-207 (2015).
  61. Kurokawa, C., et al. Interactions between Borrelia burgdorferi and ticks. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 587-600 (2020).
  62. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 473-518 (2021).
  63. Wolcott, K. A., Margos, G., Fingerle, V., Becker, N. S. Host association of Borrelia burgdorferi sensu lato: A review. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (5), 101766 (2021).
  64. Thompson, D., Watt, J. A., Brissette, C. A. Host transcriptome response to Borrelia burgdorferi sensu lato. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (2), 101638 (2021).
  65. Chaconas, G., Moriarty, T. J., Skare, J., Hyde, J. A. Live imaging. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 385-408 (2021).
  66. Kerstholt, M., Netea, M. G., Joosten, L. A. B. Borrelia burgdorferi hijacks cellular metabolism of immune cells: Consequences for host defense. Ticks and Tick-borne Diseases. 11 (3), 101386 (2020).
  67. Rudenko, N., Golovchenko, M. Sexual transmission of Lyme Borreliosis? The question that calls for an answer. Tropical Medicine and Infectious Disease. 6 (2), 87 (2021).
  68. Cutler, S. J., et al. Diagnosing Borreliosis. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 17 (1), 2-11 (2017).
  69. Middelveen, M. J., et al. Persistent Borrelia infection in patients with ongoing symptoms of Lyme disease. Healthcare. 6 (2), 33 (2018).
  70. Bernard, Q., Grillon, A., Lenormand, C., Ehret-Sabatier, L., Boulanger, N. Skin Interface, a key player for Borrelia multiplication and persistence in Lyme Borreliosis. Trends in Parasitology. 36 (3), 304-314 (2020).
  71. Bobe, J. R., et al. Recent progress in Lyme disease and remaining challenges. Frontiers in Medicine. 8, 666554 (2021).
  72. Branda, J. A., Steere, A. C. Laboratory diagnosis of lyme borreliosis. Clinical Microbiology Reviews. 34 (2), 1-45 (2021).

Tags

SpirochetesBorrelia BurgdorferiRelapsing Fever BorreliaBorrelia MiyamotoiCultureBSK-II MediumBacterial GrowthRabbit SerumGelatinAnaerobic AtmosphereIncubation Temperature

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Berthold, A., Faucillion, M., Nilsson, I., Golovchenko, M., Lloyd, V., Bergström, S., Rudenko, N. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp. (189), e64431, doi:10.3791/64431 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image