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Immunology and Infection

Méthodes de culture des spirochètes du complexe Borrelia burgdorferi Sensu Lato et de la fièvre récurrente Borrelia

Published: November 25, 2022
doi:
10.3791/64431
, , , , , ,
1Department of Biology,Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology,Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences,Institute of Parasitology

Summary

La culture in vitro est une méthode de détection directe de la présence de bactéries vivantes. Ce protocole décrit les méthodes de culture de divers spirochètes de Borrelia, y compris ceux du complexe Borrelia burgdorferi sensu lato, de la fièvre récurrente des espèces de Borrelia et de Borrelia miyamotoi. Ces espèces sont méticuleuses et à croissance lente, mais peuvent être cultivées.

Abstract

La Borrelia se compose de trois groupes d’espèces, celles du groupe de la borréliose de Lyme (LB), également connu sous le nom de B. burgdorferi sensu lato (s.l.) et récemment reclassé en Borreliella, le groupe de fièvre récurrente (RF) Borrelia, et un troisième groupe de spirochètes associés aux reptiles. Les méthodes basées sur la culture demeurent l’étalon-or pour la détection en laboratoire des infections bactériennes pour la recherche et le travail clinique, car la culture d’agents pathogènes à partir de fluides corporels ou de tissus détecte directement les agents pathogènes réplicatifs et fournit du matériel source pour la recherche. Borrelia et les spirochètes de Borreliella sont fastidieux et à croissance lente, et ne sont donc pas couramment cultivés à des fins cliniques; Cependant, la culture est nécessaire pour la recherche. Ce protocole démontre la méthodologie et les recettes nécessaires pour cultiver avec succès des spirochètes LB et RF, y compris toutes les espèces reconnues du complexe de B. burgdorferi s.l., y compris B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis etspirochètes RF, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis et B. miyamotoi. Le milieu de base pour la culture des spirochètes LB et RF est le milieu Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II ou BSK-H), qui soutient de manière fiable la croissance des spirochètes dans les cultures établies. Pour pouvoir cultiver des isolats de Borrelia nouvellement isolés à partir d’échantillons dérivés de tiques ou d’hôtes où le nombre initial de spirochètes est faible dans l’inoculum, il est préférable de modifier le milieu Kelly-Pettenkofer (MKP). Ce milieu soutient également la croissance de B. miyamotoi. Le succès de la culture des spirochètes RF dépend également de manière critique de la qualité des ingrédients.

Introduction

Borrelia est un genre de bactéries spirochètes qui englobe trois clades principaux: le groupe de la borréliose de Lyme (LB), le groupe de la fièvre récurrente (RF) et un groupe moins bien caractérisé apparemment limité aux reptiles. La taxonomie de Borrelia est en mutation avec l’avènement des méthodologies moléculaires qui permettent de comparer le génome et le protéome, comme c’est le cas pour la plupart des autres groupes taxonomiques 1,2,3,4,5,6,7. Le groupe LB (également appelé groupe de la maladie de Lyme) a traditionnellement été appelé Borrelia burgdorferi sensu lato d’après son membre le mieux caractérisé Borrelia burgdorferi sensu stricto.  Cet article utilise la terminologie actuellement la plus largement utilisée: le LB, le RF et le groupe associé aux reptiles, et décrit les protocoles de culture pour les groupes LB et RF.

Comme on peut s’y attendre pour un membre de la famille des Spirochaetaceae, Borrelia peut adopter la forme en spirale distinctement longue et mince, généralement de 20 à 30 μm de long et de 0,2 à 0,3 μm de large. Cependant, les cellules de Borrelia sont très pléomorphes et peuvent adopter de nombreuses autres formes en culture et in vivo 1,8 en raison de leur structure cellulaire et génétique complexe. Dans sa forme spirochétale, la morphologie planaire sinusoïdale résulte de la rotation de ses endoflagelles axiaux dans l’espace périplasmique entre les membranes interne et externe. Cette structure permet aux cellules d’être très mobiles, la membrane externe contenant des protéines qui permettent à la cellule d’interagir avec les tissus hôtes 9,10. L’expression des protéines de la membrane externe est étroitement régulée et affecte non seulement l’invasion du tissu de l’hôte, mais aussi l’interaction avec le système immunitaire de l’hôte11. Cette expression génique complexe permet aux cellules de Borrelia de faire la navette entre les environnements très différents des hôtes vertébrés et des vecteurs invertébrés. Le génome de Borrelia est inhabituel chez les procaryotes, constitué d’un chromosome linéaire plutôt que circulaire. En plus du chromosome linéaire, les espèces de Borrelia contiennent 7 à 21 plasmides, certains linéaires et d’autres circulaires. Les plasmides abritent la majorité des gènes nécessaires à l’adaptation et à la virulence de l’hôte, et les plasmides circulaires dérivés des prophages seraient responsables de la majorité du flux horizontal de gènes entre les cellules spirochétales12,13. Conformément à un rôle dans l’adaptation de l’hôte, certains, peut-être plusieurs ou tous, membres du groupe de la borréliose de Lyme perdent des plasmides en culture14. La souche « adaptée en laboratoire » de B. burgdorferi, B31, la mieux étudiée, ne contient que sept des neuf plasmides trouvés dans les isolats sauvages de cetteespèce15. De même, B. garinii perd des plasmides en culture16. Certaines études ont montré que les espèces RF et B. miyamotoi conservent les plasmides lorsqu’ils sont cultivés14,17, mais des travaux récents démontrent des plasmides altérés et une infectiosité avec une culture in vitro à long terme 18.

Les méthodes basées sur la culture restent l’étalon-or pour la détection en laboratoire des infections bactériennes, tant pour la recherche que pour les travaux cliniques14,17. La culture d’agents pathogènes à partir de fluides corporels ou de tissus détecte directement les agents pathogènes réplicatifs et fournit du matériel de base pour la recherche14,17. Ce protocole démontre la méthodologie et les recettes nécessaires pour cultiver avec succès les spirochètes du groupe LB ainsi que RF Borrelia et B. miyamotoi. Le milieu de base pour la culture des spirochètes de Borrelia est le milieu Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II ou BSK-H disponible dans le commerce), avec ou sans antibiotiques pour réduire la croissance des procaryotes contaminants. Ce support a été adapté d’un support utilisé à l’origine pour supporter RF Borrelia19, modifié par Stoenner20 puis par Barbour21. De nombreuses modifications ont depuis été développées, chacune ayant des effets sur la physiologie bactérienne qui peuvent affecter la croissance, l’infectiosité et la pathogénicité22. Ce milieu favorise de manière fiable la croissance des spirochètes dans des cultures établies et a été utilisé pour isoler des spirochètes à partir d’échantillons de tiques, de mammifères et cliniques23. La variante plus récente, le milieu Kelly-Pettenkofer modifié (MKP), peut améliorer le succès de l’isolement, la morphologie et la motilité lors de l’isolement de nouveaux isolats de Borrelia à partir d’échantillons environnementaux, lorsque le nombre de spirochètes présents dans l’échantillon disponible pour ensemencer la culture est faible23,24. Dans tous les cas, le succès de la culture dépend essentiellement du milieu fraîchement préparé et de l’utilisation d’ingrédients appropriés; Tous les ingrédients commerciaux ne produisent pas un milieu de haute qualité. Les cultures inoculées peuvent être facilement incubées sans agitation dans un incubateur conventionnel à 32-34 °C en présence d’une petite quantité d’oxygène ambiant résiduel. Les spirochètes de Borrelia sont anaérobies mais sont exposés dans la nature aux fluctuations des concentrations d’oxygène et de dioxyde de carbone et réagissent avec des changements dans l’expression des gènes26,27,28,29. Ainsi, l’expression génique, la croissance et d’autres études métaboliques devraient contrôler les niveaux d’oxygène et de dioxyde de carbone à l’aide d’un incubateur contrôlé par oxygène ou d’une chambre anaérobie. En culture, les cultures sont vérifiées chaque semaine, ou plus souvent, pour la présence de spirochètes avec la microscopie à fond noir ou la microscopie à contraste de phase. Les frottis de culture peuvent être colorés avec des taches d’argent, l’immunohistochimie ou l’utilisation de souches marquées par fluorescence29,30. La PCR suivie du séquençage de l’ADN est une méthode sensible et spécifique pour détecter et identifier génétiquement ou confirmer l’espèce Borrelia 30,31,32,33.

Il existe de nombreuses variantes mineures de BSK-II, et certaines sont disponibles dans le commerce. Le protocole décrit ici à la section 1 a été adapté de Barbour (1984)21. Le milieu MKP liquide est un milieu développé plus récemment et est décrit à la section 2. Il est préparé selon un protocole33,34 précédemment rapporté qui, à l’instar du milieu BSK, comporte deux étapes: la préparation du milieu de base et la préparation du milieu complet. Le milieu de culture Borrelia peut être préparé avec ou sans antibiotiques, comme décrit à la rubrique 3 ; la Loi sur les antibiotiques visant à réduire les bactéries contaminantes introduites lors de l’inoculation d’échantillons cliniques ou environnementaux, tel que décrit à la section 4; si inoculer avec Borrelia sp. culture pure, les antibiotiques peuvent ne pas être nécessaires. La constitution de stocks Borrelia à long terme est souvent importante, et un protocole pour ce faire est décrit à la section 5. La section 6 décrit l’utilisation de ces milieux pour isoler des clones purs de Borrelia sensu lato à partir d’échantillons cliniques ou environnementaux. Il existe un certain nombre d’approches possibles36; Vous trouverez ci-dessous une solution qui s’est avérée efficace. Le milieu de placage utilisé dans ce protocole est une modification du milieu de placage BSK-II37 et du milieu MKP 34 (avec du sérum de lapin augmenté à 10%38).

Protocol

Toutes les études impliquant des échantillons obtenus sur des sujets humains ont été approuvées par le comité d’examen institutionnel de l’université et/ou de l’établissement médical concerné, et le consentement éclairé écrit des participants a été obtenu avant le prélèvement des échantillons. Toutes les études portant sur des échantillons prélevés sur des animaux ont été approuvées et menées conformément aux lignes directrices du Comité d’éthique animale de l’établissement. Le cas…

Representative Results

Les milieux de culture Borrelia BSK et MKP, et leurs variantes, sont des milieux de culture riches avec des ingrédients qui doivent être préparés et stérilisés séquentiellement. Lorsqu’il est correctement préparé, le milieu BSK doit être rouge-orange et clair (Figure 1). La turbidité et les précipitations qui persistent après le réchauffement indiquent des ingrédients problématiques, une production moyenne ou une contamination; Un tel support est mieux jeté. Si de…

Discussion

La culture de bactéries en laboratoire est le tremplin de la recherche. L’avantage profond conféré par la capacité de culture est illustré par la lutte, pendant plus d’un siècle qui n’a abouti que récemment au succès, pour la culture Treponema pallidum, le spirochète qui est l’agent étiologique de la syphilis44. Les spirochètes de Borrelia sont également difficiles à cultiver, mais la culture est possible 23,24,34,44,45,46,47,48,49.<su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été partiellement financés par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada et la Fondation canadienne de la maladie de Lyme (AB et VL), le Conseil suédois de la recherche (SB, M-LF et IN), LE PROJET TAČR GAMA 2 – « Support of application potential verification 2.0 at the Biology Centre CAS » (TP01010022) (MG et NR), et par une subvention du ministère de la Santé de la République tchèque NV19-05-00191 (MG et NR). Nous remercions S. Vranjes (2021, laboratoire Rudenko) pour l’image de la figure 4 et J. Thomas-Ebbett (2021, laboratoire Lloyd) pour les images de la figure 5. Nous remercions tous les chercheurs qui ont contribué au domaine et nous nous excusons auprès de ceux dont nous n’avons pas pu citer le travail en raison de contraintes d’espace.

Materials

1.7 mL tubes VWR 87003-294 Standard item – any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter  VWR 28145-501 Standard item – any supplier will do
10 µL barrier pipette tip Neptune BT10XLS3 Standard item – any supplier will do
10 mL Serological pipettes  Celltreat 229011B Standard item – any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip Neptune BT1000.96 Standard item – any supplier will do
15 mL tube Celltreat 188261 Standard item – any supplier will do
20 µL barrier pipette tip Neptune BT20 Standard item – any supplier will do
20 mL Sterile syringe  BD 309661 Standard item – any supplier will do
200 µL barrier pipette tip Neptune BT200 Standard item – any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes Fisher Scientific 14-933C Standard item – any supplier will do
25 mL Serological pipettes Celltreat 229025B Standard item – any supplier will do
3 mL Sterile syringe BD 309657 Standard item – any supplier will do
35% BSA  Sigma A-7409 Source is important – see note
5 mL Serological pipettes  Celltreat 229006B Standard item – any supplier will do
50 mL tube Celltreat 229421 Standard item – any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes  Schott Schott Nr. 26 135 115 Standard item – any supplier will do
Amikacine Sigma PHR1654 Standard item – any supplier will do
Amphotericin B Sigma A9528-100MG Standard item – any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole Sigma PHR1126-1G Standard item – any supplier will do
BBL Brucella broth  BD 211088 Standard item – any supplier will do
Biosafety Cabinet Labconco 302419100 Standard item – any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top – ACD) Fisher Scientific BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) Standard item – any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]  Darlynn biologicals BB83-500 Standard item – any supplier will do
centrifuge  Eppendorf model 5430 Standard item – any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate Sigma C-8532 100 g Standard item – any supplier will do
CMRL Gibco BRL 21540 500 mL Standard item – any supplier will do
CMRL-1066 Gibco 21-510-018 Standard item – any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene) Fisher Scientific 5000-0020 Standard item – any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm Sigma P7741 Standard item – any supplier will do
Digital Incubator VWR model 1545 Standard item – any supplier will do
DMSO ThermoFisher D12345 Standard item – any supplier will do
Filters for filter sterilization Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane SCGPU05RE Standard item – any supplier will do
Gelatin Difco BD 214340 500 g Standard item – any supplier will do
Glass Culture Tubes Fisher Scientific 99449-20 Standard item – any supplier will do
Glucose Sigma G-7021 1 kg Standard item – any supplier will do
Glycerol Sigma G5516 Standard item – any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) Labwissen Model 3220 Standard item – any supplier will do
HEPES Sigma  H-3784 100 g Standard item – any supplier will do
N-acetylglucoseamine Sigma  A-3286 25 g Standard item – any supplier will do
Neopeptone Difco  BD 211681 500 g Standard item – any supplier will do
Neubauer Hematocytometer Sigma  Z359629 Standard item – any supplier will do
Phase contrast microscope  Leitz Standard item – any supplier will do
Phosphomycin Sigma P5396-1G Standard item – any supplier will do
Phosphomycine Sigma P5396 Standard item – any supplier will do
Pipetboy Integra Standard item – any supplier will do
Precision Standard Balance OHAUS model TS200S Standard item – any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt) Sigma P-8574 25 g Standard item – any supplier will do
Rabbit Serum  Gibco 16-120-032 Source is important 
Rabbit Serum  Sigma R-4505  100 mL Source is important 
Rifampicin Sigma R3501-1G Standard item – any supplier will do
Sodium bicarbonate Sigma S-5761     500 g Standard item – any supplier will do
Sufametaxazole  Sigma PHR1126 Standard item – any supplier will do
TC Yeastolate Difco  BD 255752 100 g Standard item – any supplier will do
Transfer Pipettes VWR 470225-044 Standard item – any supplier will do
Trimethoprim Sigma PHR1056 Standard item – any supplier will do
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References

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Berthold, A., Faucillion, M., Nilsson, I., Golovchenko, M., Lloyd, V., Bergström, S., Rudenko, N. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp. (189), e64431, doi:10.3791/64431 (2022).
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