JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Teeltmethoden van Spirocheten uit Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex en Relapsing Fever Borrelia

Published: November 25, 2022
doi:
10.3791/64431
, , , , , ,
1Department of Biology,Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology,Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences,Institute of Parasitology

Summary

In vitro kweek is een directe detectiemethode voor de aanwezigheid van levende bacteriën. Dit protocol beschrijft methoden voor de kweek van diverse Borrelia spirocheten, waaronder die van het Borrelia burgdorferi sensu lato-complex, recidiverende koorts Borrelia-soorten en Borrelia miyamotoi. Deze soorten zijn kieskeurig en langzaam groeiend, maar kunnen worden gekweekt.

Abstract

De Borrelia bestaat uit drie groepen soorten, die van de Lyme borreliose (LB) groep, ook bekend als B. burgdorferi sensu lato (s.l.) en onlangs opnieuw geclassificeerd in Borreliella, de relapsing fever (RF) groep Borrelia, en een derde reptielen-geassocieerde groep spirocheten. Op cultuur gebaseerde methoden blijven de gouden standaard voor de laboratoriumdetectie van bacteriële infecties voor zowel onderzoek als klinisch werk, omdat de kweek van pathogenen uit lichaamsvloeistoffen of weefsels direct replicerende pathogenen detecteert en bronmateriaal voor onderzoek biedt. Borrelia en Borreliella spirocheten zijn kieskeurig en langzaam groeiend en worden daarom niet vaak gekweekt voor klinische doeleinden; Cultuur is echter noodzakelijk voor onderzoek. Dit protocol demonstreert de methodologie en recepten die nodig zijn om LB- en RF-spirocheten met succes te kweken, inclusief alle erkende soorten uit het B. burgdorferi s.l.-complex, waaronder B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii / bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis en RFspirocheten, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis en B. miyamotoi. Het basismedium voor het kweken van LB- en RF-spirocheten is het Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II of BSK-H) medium, dat de groei van spirocheten in gevestigde culturen betrouwbaar ondersteunt. Om nieuw geïsoleerde Borrelia-isolaten te kunnen kweken uit van teken of gastheer afgeleide monsters waarbij het initiële spirocheetgetal laag is in het entmateriaal, heeft gemodificeerd Kelly-Pettenkofer (MKP) -medium de voorkeur. Dit medium ondersteunt ook de groei van B. miyamotoi. Het succes van de teelt van RF-spirocheten hangt ook kritisch af van de kwaliteit van de ingrediënten.

Introduction

Borrelia is een geslacht van spirocheetbacteriën dat drie belangrijke clades omvat: de Lyme-borreliose (LB) -groep, de relapsing fever (RF) -groep en een minder goed gekarakteriseerde groep die schijnbaar beperkt is tot reptielen. Borrelia-taxonomie is in beweging met de komst van moleculaire methodologieën die genoom- en proteoomvergelijkingen mogelijk maken, zoals geldt voor de meeste andere taxonomische groepen 1,2,3,4,5,6,7. De LB-groep (ook wel de ziekte van Lyme-groep genoemd) wordt van oudsher Borrelia burgdorferi sensu lato genoemd naar zijn best gekarakteriseerde lid Borrelia burgdorferi sensu stricto.  Dit artikel gebruikt de momenteel meest gebruikte terminologie: de LB, de RF en de reptielen-geassocieerde groep, en beschrijft de kweekprotocollen voor de LB- en de RF-groepen.

Zoals te verwachten is voor een lid van de familie Spirochaetaceae, kan Borrelia de opvallend lange en dunne spiraalvorm aannemen, meestal 20-30 μm lang en 0,2-0,3 μm breed. Borrelia-cellen zijn echter zeer pleomorf en kunnen vele andere vormen aannemen in zowel cultuur als in vivo 1,8 als gevolg van hun complexe cellulaire en genetische structuur. In zijn spirochetale vorm is de morfologie van de vlakke sinusgolf het resultaat van zijn axiale endoflagella die roteert in de periplasmatische ruimte tussen de binnenste en buitenste membranen. Deze structuur stelt de cellen in staat om zeer beweeglijk te zijn, waarbij het buitenmembraan eiwitten bevat die de cel in staat stellen om te interageren met gastheerweefsels 9,10. De expressie van de buitenste membraaneiwitten is strak gereguleerd en beïnvloedt niet alleen de invasie van gastheerweefsel, maar ook de interactie met het immuunsysteem van de gastheer11. Deze complexe genexpressie stelt de Borrelia-cellen in staat om te pendelen tussen de zeer verschillende omgevingen van gewervelde gastheren en ongewervelde vectoren. Het genoom van Borrelia is ongebruikelijk onder prokaryoten, bestaande uit een lineair in plaats van een cirkelvormig chromosoom. Naast het lineaire chromosoom bevatten Borrelia-soorten 7-21 plasmiden, sommige lineair en sommige cirkelvormig. De plasmiden herbergen de meerderheid van de genen die nodig zijn voor gastheeraanpassing en virulentie, en de circulaire plasmiden afgeleid van profagen worden verondersteld verantwoordelijk te zijn voor de meerderheid van de horizontale genstroom tussen spirochetale cellen12,13. In overeenstemming met een rol in gastheeradaptatie, verliezen sommige, mogelijk veel of alle, leden van de Lyme-borreliosegroep plasmiden in cultuur14. De best bestudeerde “laboratorium aangepaste” stam van B. burgdorferi, B31, heeft slechts zeven van de negen plasmiden gevonden in wilde isolaten van deze soort15. Evenzo verliest B. garinii plasmiden in cultuur16. Sommige studies hebben aangetoond dat RF-soorten en B. miyamotoi plasmiden behouden wanneer ze worden gekweekt14,17, maar recent werk toont veranderde plasmiden en infectiviteit met langdurige in vitro kweek 18.

Op cultuur gebaseerde methoden blijven de gouden standaard voor de laboratoriumdetectie van bacteriële infecties, voor zowel onderzoek als klinisch werk14,17. De kweek van pathogenen uit lichaamsvloeistoffen of weefsels detecteert direct replicerende pathogenen en levert bronmateriaal voor onderzoek14,17. Dit protocol demonstreert de methodologie en recepten die nodig zijn om de spirocheten van de LB-groep en RF Borrelia en B. miyamotoi met succes te kweken. Het basismedium voor het kweken van Borrelia spirocheten is het Barbour-Stoenner-Kelly medium (BSK-II of het in de handel verkrijgbare BSK-H), met of zonder antibiotica om de groei van vervuilende prokaryoten te verminderen. Dit medium werd aangepast van een medium dat oorspronkelijk werd gebruikt om RF Borrelia19 te ondersteunen, verder aangepast door Stoenner20 en vervolgens door Barbour21. Sindsdien zijn er veel modificaties ontwikkeld, elk met effecten op de bacteriële fysiologie die de groei, infectiviteit en pathogeniciteit kunnen beïnvloeden22. Dit medium ondersteunt op betrouwbare wijze de groei van spirocheten in gevestigde culturen en is gebruikt om spirocheten te isoleren uit teken-, zoogdier- en klinische monsters23. De meer recent ontwikkelde variatie, gemodificeerd Kelly-Pettenkofer (MKP) medium, kan zorgen voor een beter isolatiesucces, morfologie en beweeglijkheid bij het isoleren van nieuwe Borrelia-isolaten uit omgevingsmonsters, wanneer het aantal spirocheten dat aanwezig is in het monster dat beschikbaar is om de cultuur te zaaien laagis 23,24. In alle gevallen is het succes van de teelt kritisch afhankelijk van het vers bereide medium en het gebruik van geschikte ingrediënten; Niet alle commerciële ingrediënten produceren een medium van hoge kwaliteit. Geënte culturen kunnen gemakkelijk worden geïncubeerd zonder te schudden in een conventionele 32-34 °C incubator in de aanwezigheid van een kleine hoeveelheid resterende omgevingszuurstof. Borrelia spirocheten zijn anaëroben, maar worden in de natuur blootgesteld aan schommelingen in zuurstof- en koolstofdioxideconcentraties en reageren met veranderingen in genexpressie26,27,28,29. Genexpressie, groei en andere metabole studies moeten dus controleren op zuurstof- en koolstofdioxideniveaus met behulp van een zuurstofgestuurde incubator of anaerobe kamer. In cultuur worden culturen wekelijks, of vaker, gecontroleerd op de aanwezigheid van spirocheten met darkfieldmicroscopie of fasecontrastmicroscopie. Kweekuitstrijkjes kunnen worden gekleurd met zilvervlekken, immunohistochemie of door het gebruik van fluorescerend gelabelde stammen29,30. PCR gevolgd door DNA-sequencing is een gevoelige en specifieke methode om de Borrelia-soort te detecteren en genetisch te identificeren of te bevestigen30,31,32,33.

Er bestaan veel kleine variaties op BSK-II en sommige zijn in de handel verkrijgbaar. Het hier in deel 1 beschreven protocol is overgenomen uit Barbour (1984)21. Vloeibaar MKP-medium is een recenter ontwikkeld medium en wordt beschreven in rubriek 2. Het wordt bereid volgens een eerder gerapporteerd protocol33,34, dat, net als BSK-medium, uit twee stappen bestaat: bereiding van basismedium en bereiding van volledig medium. Borrelia kweekmedium kan worden bereid met of zonder antibiotica, zoals beschreven in rubriek 3; de antibioticawet ter vermindering van verontreinigende bacteriën die worden geïntroduceerd bij het inenten met klinische of omgevingsmonsters, zoals beschreven in rubriek 4; bij inenten met pure Borrelia sp. cultuur zijn antibiotica mogelijk niet nodig. Het maken van Borrelia-aandelen op lange termijn is vaak belangrijk en een protocol hiervoor wordt beschreven in hoofdstuk 5. Rubriek 6 beschrijft het gebruik van deze media om zuivere Borrelia sensu lato-klonen te isoleren uit klinische of omgevingsmonsters. Er zijn een aantal benaderingen mogelijk36; Hieronder is er een die effectief blijkt te zijn. Het beplatingsmedium dat in dit protocol wordt gebruikt, is een modificatie van BSK-II-platingmedium37 en MKP-medium 34 (met konijnenserum verhoogd tot 10%38).

Protocol

Alle studies met monsters verkregen van menselijke proefpersonen werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van de relevante universiteit en / of medische faciliteit, en schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van deelnemers voordat de monsters werden verzameld. Alle studies met monsters verkregen van dieren werden goedgekeurd en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de institutionele commissie voor dierethiek. In voorkomend geval zijn goedkeuringen verkregen voor milieubemonstering. <p cla…

Representative Results

Borrelia-cultuurmedia BSK en MKP, en varianten, zijn rijke cultuurmedia met ingrediënten die sequentieel moeten worden bereid en gesteriliseerd. Indien correct bereid, moet BSK-medium roodoranje en helder zijn (figuur 1). Troebelheid en neerslag die na opwarming aanhouden, duiden op problematische ingrediënten, gemiddelde productie of verontreiniging; Een dergelijk medium kan het beste worden weggegooid. Als gelatine wordt toegevoegd aan BSK en met MKP, zal het medium gelatineus z…

Discussion

De laboratoriumkweek van bacteriën is de springplank voor onderzoek. Het diepgaande voordeel dat wordt verleend door het vermogen om te kweken, wordt geïllustreerd door de strijd, meer dan een eeuw die pas onlangs in succes culmineerde, om Treponema pallidum te kweken, de spirocheet die de etiologische agent van syfilis is44. Borrelia spirocheten zijn ook een uitdaging voor cultuur, maar cultuur is mogelijk 23,24,34,44,45,46,47,48,49.<sup clas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Natural Science and Engineering Research Council of Canada en de Canadian Lyme disease Foundation (AB en VL), de Swedish Research Council (SB, M-LF en IN), TAČR GAMA 2 project – “Support of application potential verification 2.0 at the Biology Centre CAS” (TP01010022) (MG en NR), en door een subsidie van het Ministerie van Volksgezondheid van de Tsjechische Republiek NV19-05-00191 (MG en NR). We danken S. Vranjes (2021, Rudenko lab) voor de afbeelding in Figuur 4 en J. Thomas-Ebbett (2021, Lloyd lab) voor de beelden in Figuur 5. We bedanken alle onderzoekers die hebben bijgedragen aan het veld en verontschuldigen ons bij degenen wiens werk we niet konden citeren vanwege ruimtebeperkingen.

Materials

1.7 mL tubes VWR 87003-294 Standard item – any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter  VWR 28145-501 Standard item – any supplier will do
10 µL barrier pipette tip Neptune BT10XLS3 Standard item – any supplier will do
10 mL Serological pipettes  Celltreat 229011B Standard item – any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip Neptune BT1000.96 Standard item – any supplier will do
15 mL tube Celltreat 188261 Standard item – any supplier will do
20 µL barrier pipette tip Neptune BT20 Standard item – any supplier will do
20 mL Sterile syringe  BD 309661 Standard item – any supplier will do
200 µL barrier pipette tip Neptune BT200 Standard item – any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes Fisher Scientific 14-933C Standard item – any supplier will do
25 mL Serological pipettes Celltreat 229025B Standard item – any supplier will do
3 mL Sterile syringe BD 309657 Standard item – any supplier will do
35% BSA  Sigma A-7409 Source is important – see note
5 mL Serological pipettes  Celltreat 229006B Standard item – any supplier will do
50 mL tube Celltreat 229421 Standard item – any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes  Schott Schott Nr. 26 135 115 Standard item – any supplier will do
Amikacine Sigma PHR1654 Standard item – any supplier will do
Amphotericin B Sigma A9528-100MG Standard item – any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole Sigma PHR1126-1G Standard item – any supplier will do
BBL Brucella broth  BD 211088 Standard item – any supplier will do
Biosafety Cabinet Labconco 302419100 Standard item – any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top – ACD) Fisher Scientific BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) Standard item – any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]  Darlynn biologicals BB83-500 Standard item – any supplier will do
centrifuge  Eppendorf model 5430 Standard item – any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate Sigma C-8532 100 g Standard item – any supplier will do
CMRL Gibco BRL 21540 500 mL Standard item – any supplier will do
CMRL-1066 Gibco 21-510-018 Standard item – any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene) Fisher Scientific 5000-0020 Standard item – any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm Sigma P7741 Standard item – any supplier will do
Digital Incubator VWR model 1545 Standard item – any supplier will do
DMSO ThermoFisher D12345 Standard item – any supplier will do
Filters for filter sterilization Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane SCGPU05RE Standard item – any supplier will do
Gelatin Difco BD 214340 500 g Standard item – any supplier will do
Glass Culture Tubes Fisher Scientific 99449-20 Standard item – any supplier will do
Glucose Sigma G-7021 1 kg Standard item – any supplier will do
Glycerol Sigma G5516 Standard item – any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) Labwissen Model 3220 Standard item – any supplier will do
HEPES Sigma  H-3784 100 g Standard item – any supplier will do
N-acetylglucoseamine Sigma  A-3286 25 g Standard item – any supplier will do
Neopeptone Difco  BD 211681 500 g Standard item – any supplier will do
Neubauer Hematocytometer Sigma  Z359629 Standard item – any supplier will do
Phase contrast microscope  Leitz Standard item – any supplier will do
Phosphomycin Sigma P5396-1G Standard item – any supplier will do
Phosphomycine Sigma P5396 Standard item – any supplier will do
Pipetboy Integra Standard item – any supplier will do
Precision Standard Balance OHAUS model TS200S Standard item – any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt) Sigma P-8574 25 g Standard item – any supplier will do
Rabbit Serum  Gibco 16-120-032 Source is important 
Rabbit Serum  Sigma R-4505  100 mL Source is important 
Rifampicin Sigma R3501-1G Standard item – any supplier will do
Sodium bicarbonate Sigma S-5761     500 g Standard item – any supplier will do
Sufametaxazole  Sigma PHR1126 Standard item – any supplier will do
TC Yeastolate Difco  BD 255752 100 g Standard item – any supplier will do
Transfer Pipettes VWR 470225-044 Standard item – any supplier will do
Trimethoprim Sigma PHR1056 Standard item – any supplier will do
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aberer, E., Duray, P. H. Morphology of Borrelia burgdorferi: Structural patterns of cultured borreliae in relation to staining methods. Journal of Clinical Microbiology. 29 (4), 764-772 (1991).
  2. Estrada-Peña, A., Cabezas-Cruz, A. Phyloproteomic and functional analyses do not support a split in the genus Borrelia (phylum Spirochaetes). BMC Evolutionary Biology. 19 (1), 54 (2019).
  3. Parte, A. C., Carbasse, J. S., Meier-Kolthoff, J. P., Reimer, L. C., Göker, M. List of prokaryotic names with standing in nomenclature (LPSN) moves to the DSMZ. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (11), 5607-5612 (2020).
  4. . List of prokaryotic names with standing in nomenclature Genus Borrelia Available from: https://lpsn.dsmz.de/gnus/borrelia (2022)
  5. Margos, G., et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 13 (12), 0208432 (2018).
  6. Gupta, R. S., et al. Distinction between Borrelia and Borreliella is more robustly supported by molecular and phenotypic characteristics than all other neighbouring prokaryotic genera: Response to Margos’ et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 14 (12), 0221397 (2019).
  7. Barbour, A. G., Qiu, W., Trujillo, S., Dedysh, P., DeVos, B., Hedlund, P., Kampfer, F. A., Rainey, W. B., Whitman, Borreliella. Bergey’s Manual of Systematics of Archaea and Bacteria. , 1-22 (2019).
  8. Rudenko, N., Golovchenko, M., Kybicova, K., Vancova, M. Metamorphoses of Lyme disease spirochetes: Phenomenon of Borrelia persisters. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-10 (2019).
  9. Strnad, M., et al. Nanomechanical mechanisms of Lyme disease spirochete motility enhancement in extracellular matrix. Communications Biology. 4 (1), 268 (2021).
  10. Niddam, A. F., et al. Plasma fibronectin stabilizes Borrelia burgdorferi-endothelial interactions under vascular shear stress by a catch-bond mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (17), 3490-3498 (2017).
  11. Anderson, C., Brissette, C. A. The brilliance of Borrelia: Mechanisms of host immune evasion by Lyme disease-causing Spirochetes. Pathogens. 10 (3), 1-17 (2021).
  12. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
  13. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 409-454 (2021).
  14. Lopez, J. E., et al. Relapsing fever spirochetes retain infectivity after prolonged in vitro cultivation. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 8 (6), 813-820 (2008).
  15. Schwan, T. G., Burgdorfer, W., Garon, C. F. Changes in infectivity and plasmid profile of the Lyme disease spirochete, Borrelia Burgdorferi, as a result of in vitro cultivation. Infection and Immunity. 56 (8), 1831-1836 (1988).
  16. Biškup, U. G., Strle, F., Ružić-Sabljić, E. Loss of plasmids of Borrelia burgdorferi sensu lato during prolonged in vitro cultivation. Plasmid. 66 (1), 1-6 (2011).
  17. Gilmore, R. D., et al. Borrelia miyamotoi strain LB-2001 retains plasmids and infectious phenotype throughout continuous culture passages as evaluated by multiplex PCR. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (1), 101587 (2021).
  18. Krishnavajhala, A., Armstrong, B. A., Lopez, J. E. The impact of in vitro cultivation on the natural life cycle of the tick-borne relapsing fever spirochete Borrelia turicatae. PLoS One. 15 (10), 0239089 (2020).
  19. Kelly, R. Cultivation of Borrelia hermsi. Science. 173 (3995), 443-444 (1971).
  20. Stoenner, H. G. Biology of Borrelia hermsii in Kelly Medium. Applied Microbiology. 28 (4), 540-543 (1974).
  21. Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale Journal of Biology and Medicine. 57 (4), 521-525 (1984).
  22. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  23. Pollack, R. J., Telford, S. R., Spielman, A. Standardization of medium for culturing Lyme disease spirochetes. Journal of Clinical Microbiology. 31 (5), 1251-1255 (1993).
  24. Ružiæ-Sabljiæ, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622 (2017).
  25. Ružić-Sabljić, E., et al. Comparison of isolation rate of Borrelia burgdorferi sensu lato in two different culture media, MKP and BSK-H. Clinical Microbiology and Infection. 20 (7), 636-641 (2014).
  26. Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
  27. Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
  28. Raffel, S. J., Williamson, B. N., Schwan, T. G., Gherardini, F. C. Colony formation in solid medium by the relapsing fever spirochetes Borrelia hermsii and Borrelia turicatae. Ticks and Tick-borne Diseases. 9 (2), 281-287 (2018).
  29. Margos, G., et al. Long-term in vitro cultivation of Borrelia miyamotoi. Ticks and Tick-borne Diseases. 6 (2), 181-184 (2015).
  30. Middelveen, M. J., et al. Culture and identification of Borrelia spirochetes in human vaginal and seminal secretions. F1000Research. 3, 309 (2014).
  31. Moriarty, T. J., et al. Real-time high resolution 3D imaging of the Lyme disease spirochete adhering to and escaping from the vasculature of a living host. PLoS Pathogens. 4 (6), 1000090 (2008).
  32. Cerar, T., Korva, M., Avšič-Županc, T., Ružić-Sabljić, E. Detection, identification and genotyping of Borrellia spp. In rodents in Slovenia by PCR and culture. BMC Veterinary Research. 11, 188 (2015).
  33. Liebisch, G., Sohns, B., Bautsch, W. Detection and typing of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus ticks attached to human skin by PCR. Journal of Clinical Microbiology. 36 (11), 3355-3358 (1998).
  34. Ružić-Sabljić, E., Strle, F. Comparison of growth of Borrelia afzelii, B. gavinii, and B. burgdorferi sense strict in MKP and BSK-II medium. International Journal of Medical Microbiology. 294 (6), 407-412 (2004).
  35. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Schierz, G. European Borrelia burgdorferi isolated from humans and ticks culture conditions and antibiotic susceptibility. Zentralblatt fur Bakteriologie Mikrobiologie und Hygiene. Series A, Medical Microbiology, Infectious Diseases, Virology, Parasitology. 263 (1-2), 112-118 (1986).
  36. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Reinhardt, S. Culture of Borrelia burgdorferi on six solid media. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (12), 1076-1079 (1991).
  37. Rosa, P. A., Hogan, D. Colony formation by Borrelia burgdorferi in solid medium: clonal analysis of osp locus variants. First International Conference on Tick Borne Pathogens at the Host-Vector Interface: An Agenda for Research. , 95-103 (1992).
  38. Wagemakers, A., Oei, A., Fikrig, M. M., Miellet, W. R., Hovius, J. W. The relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi is cultivable in a modified Kelly-Pettenkofer medium, and is resistant to human complement. Parasites and Vectors. 7 (1), 4-9 (2014).
  39. Oliver, J. H., et al. First isolation and cultivation of Borrelia burgdorferi sensu lato from Missouri. Journal of Clinical Microbiology. 36 (1), 1-5 (1998).
  40. Greenfield, E. A. Myeloma and hybridoma cell counts and viability checks. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), 689-690 (2019).
  41. Baradaran-Dilmaghani, R., Stanek, G. In vitro susceptibility of thirty borrelia strains from various sources against eight antimicrobial chemotherapeutics. Infection. 24 (1), 60-63 (1996).
  42. Ružić-Sabljić, E., Podreka, T., Maraspin, V., Strle, F. Susceptibility of Borrelia afzelii strains to antimicrobial agents. International Journal of Antimicrobial Agents. 25 (6), 474-478 (2005).
  43. Sicklinger, M., Wienecke, R., Neubert, U. In vitro susceptibility testing of four antibiotics against Borrelia burgdorferi: A comparison of results for the three genospecies Borrelia afzelii, Borrelia garinii, and Borrelia burgdorferi sensu stricto. Journal of Clinical Microbiology. 41 (4), 1791-1793 (2003).
  44. Edmondson, D. G., Hu, B., Norris, S. J. Long-term in vitro culture of the syphilis spirochete treponema pallidum subsp. Pallidum. mBio. 9 (3), 01153 (2018).
  45. Wilhelmsson, P., et al. Prevalence and diversity of Borrelia species in ticks that have bitten humans in Sweden. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 4169-4176 (2010).
  46. Toledo, A., et al. Phylogenetic analysis of a virulent Borrelia species isolated from patients with relapsing fever. Journal of Clinical Microbiology. 48 (7), 2484-2489 (2010).
  47. Elbir, H., et al. Genome sequence of the Asiatic species Borrelia persica. Genome Announcements. 2 (1), 01127 (2014).
  48. Sapi, E., et al. Improved culture conditions for the growth and detection of Borrelia from human serum. International Journal of Medical Sciences. 10 (4), 362-376 (2013).
  49. Liveris, D., et al. Quantitative detection of Borrelia burgdorferi in 2-millimeter skin samples of erythema migrans lesions: Correlation of results with clinical and laboratory findings. Journal of Clinical Microbiology. 40 (4), 1249-1253 (2002).
  50. Wormser, G. P., et al. Comparison of the yields of blood cultures using serum or plasma from patients with early Lyme disease. Journal of Clinical Microbiology. 38 (4), 1648-1650 (2000).
  51. Lagal, V., Postic, D., Ruzic-Sabljic, E., Baranton, G. Genetic diversity among Borrelia strains determined by single-strand conformation polymorphism analysis of the ospC gene and its association with invasiveness. Journal of Clinical Microbiology. 41 (11), 5059-5065 (2003).
  52. Lin, Y. P., Diuk-Wasser, M. A., Stevenson, B., Kraiczy, P. Complement evasion contributes to Lyme Borreliae-host associations. Trends in Parasitology. 36 (7), 634-645 (2020).
  53. Real-time PCR: understanding Ct. Application Note Real-time PCR. Thermo Fisher Scientific Inc Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/PG1503-PJ9169-CO019879-Re-brand-Real-Time-PCR-Undertanding-Ct-Value-Americas-FHR.pdf (2016)
  54. Adams, B., Walter, K. S., Diuk-Wasser, M. A. Host specialisation, immune cross-reaction and the composition of communities of co-circulating Borrelia strains. Bulletin of Mathematical Biology. 83 (6), 66 (2021).
  55. Marosevic, D., et al. First insights in the variability of Borrelia recurrentis genomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (9), 0005865 (2017).
  56. Koetsveld, J., et al. Development and optimization of an in vitro cultivation protocol allows for isolation of Borrelia miyamotoi from patients with hard tick-borne relapsing fever. Clinical Microbiology and Infection. 23 (7), 480-484 (2017).
  57. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16 (2020).
  58. Replogle, A. J., et al. Isolation of Borrelia miyamotoi and other Borreliae using a modified BSK medium. Scientific Reports. 11 (1), 1926 (2021).
  59. Stanek, G., Reiter, M. The expanding Lyme Borrelia complex-clinical significance of genomic species. Clinical Microbiology and Infection. 17 (4), 487-493 (2011).
  60. Seifert, S. N., Khatchikian, C. E., Zhou, W., Brisson, D. Evolution and population genomics of the Lyme borreliosis pathogen, Borrelia burgdorferi. Trends in Genetics. 31 (4), 201-207 (2015).
  61. Kurokawa, C., et al. Interactions between Borrelia burgdorferi and ticks. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 587-600 (2020).
  62. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 473-518 (2021).
  63. Wolcott, K. A., Margos, G., Fingerle, V., Becker, N. S. Host association of Borrelia burgdorferi sensu lato: A review. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (5), 101766 (2021).
  64. Thompson, D., Watt, J. A., Brissette, C. A. Host transcriptome response to Borrelia burgdorferi sensu lato. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (2), 101638 (2021).
  65. Chaconas, G., Moriarty, T. J., Skare, J., Hyde, J. A. Live imaging. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 385-408 (2021).
  66. Kerstholt, M., Netea, M. G., Joosten, L. A. B. Borrelia burgdorferi hijacks cellular metabolism of immune cells: Consequences for host defense. Ticks and Tick-borne Diseases. 11 (3), 101386 (2020).
  67. Rudenko, N., Golovchenko, M. Sexual transmission of Lyme Borreliosis? The question that calls for an answer. Tropical Medicine and Infectious Disease. 6 (2), 87 (2021).
  68. Cutler, S. J., et al. Diagnosing Borreliosis. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 17 (1), 2-11 (2017).
  69. Middelveen, M. J., et al. Persistent Borrelia infection in patients with ongoing symptoms of Lyme disease. Healthcare. 6 (2), 33 (2018).
  70. Bernard, Q., Grillon, A., Lenormand, C., Ehret-Sabatier, L., Boulanger, N. Skin Interface, a key player for Borrelia multiplication and persistence in Lyme Borreliosis. Trends in Parasitology. 36 (3), 304-314 (2020).
  71. Bobe, J. R., et al. Recent progress in Lyme disease and remaining challenges. Frontiers in Medicine. 8, 666554 (2021).
  72. Branda, J. A., Steere, A. C. Laboratory diagnosis of lyme borreliosis. Clinical Microbiology Reviews. 34 (2), 1-45 (2021).

Tags

SpirochetesBorrelia BurgdorferiRelapsing Fever BorreliaBorrelia MiyamotoiCultureBSK-II MediumBacterial GrowthRabbit SerumGelatinAnaerobic AtmosphereIncubation Temperature

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Berthold, A., Faucillion, M., Nilsson, I., Golovchenko, M., Lloyd, V., Bergström, S., Rudenko, N. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp. (189), e64431, doi:10.3791/64431 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image