JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Методы культивирования спирохет из комплекса Borrelia burgdorferi Sensu Lato и боррелии возвратного тифа

Published: November 25, 2022
doi:
10.3791/64431
, , , , , ,
1Department of Biology,Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology,Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences,Institute of Parasitology

Summary

Культура in vitro является прямым методом обнаружения присутствия живых бактерий. В этом протоколе описываются методы культивирования различных спирохет Borrelia, в том числе комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato, видов Borrelia при возвратном тифе и Borrelia miyamotoi. Эти виды привередливы и медленно растут, но их можно культивировать.

Abstract

Боррелии состоят из трех групп видов: группы боррелиоза Лайма (LB), также известной как B. burgdorferi sensu lato (s.l.) и недавно реклассифицированной в Borreliella, группы возвратного тифа (RF) Borrelia и третьей группы спирохет, связанных с рептилиями. Методы, основанные на культуре, остаются золотым стандартом лабораторного выявления бактериальных инфекций как для исследовательской, так и для клинической работы, поскольку культура патогенов из жидкостей или тканей организма непосредственно обнаруживает реплицирующиеся патогены и предоставляет исходный материал для исследований. Боррелии и спирохеты Borreliella привередливы и медленно растут, поэтому обычно не культивируются в клинических целях; Тем не менее, культура необходима для исследований. Этот протокол демонстрирует методологию и рецепты, необходимые для успешного культивирования спирохет LB и RF, включая все признанные виды из комплекса B. burgdorferi s.l., включая B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis иRF спирохеты, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis и B. miyamotoi. Основной средой для выращивания спирохет LB и RF является среда Барбура-Штеннера-Келли (BSK-II или BSK-H), которая надежно поддерживает рост спирохет в устоявшихся культурах. Чтобы иметь возможность выращивать недавно изолированные изоляты Borrelia из образцов, полученных от клещей или хозяев, где исходное число спирохеты в инокуляте низкое, предпочтительна модифицированная среда Келли-Петтенкофера (MKP). Эта среда также поддерживает рост B. miyamotoi. Успех культивирования RF-спирохет также критически зависит от качества ингредиентов.

Introduction

Borrelia — род спирохетных бактерий, который включает в себя три основные клады: группу боррелиоза Лайма (LB), группу возвратного тифа (RF) и менее хорошо охарактеризованную группу, по-видимому, ограниченную рептилиями. Таксономия боррелий находится в постоянном движении с появлением молекулярных методологий, которые позволяют сравнивать геном и протеом, как и большинство других таксономических групп 1,2,3,4,5,6,7. Группа LB (также называемая группой болезни Лайма) традиционно называлась Borrelia burgdorferi sensu lato в честь ее наиболее охарактеризованного члена Borrelia burgdorferi sensu stricto.  В этой статье используется наиболее широко используемая в настоящее время терминология: LB, RF и группа, связанная с рептилиями, и описываются протоколы культивирования для групп LB и RF.

Как и следовало ожидать от члена семейства Spirochaetaceae, боррелии могут принимать отчетливо длинную и тонкую спиральную форму, обычно 20-30 мкм в длину и 0,2-0,3 мкм в ширину. Тем не менее, клетки Borrelia обладают высокой плеоморфностью и могут принимать множество других форм как в культуре, так и in vivo 1,8 в результате их сложной клеточной и генетической структуры. В своей спирохетальной форме плоская синусоидальная морфология является результатом вращения ее осевых эндофлагелл в периплазматическом пространстве между внутренней и внешней мембранами. Эта структура позволяет клеткам быть очень подвижными, а внешняя мембрана содержит белки, которые позволяют клетке взаимодействовать с тканями хозяина 9,10. Экспрессия белков внешней мембраны жестко регулируется и влияет не только на инвазию ткани хозяина, но и на взаимодействие с иммунной системой хозяина11. Эта сложная экспрессия генов позволяет клеткам Borrelia перемещаться между очень разными средами позвоночных хозяев и беспозвоночных переносчиков. Геном боррелий необычен среди прокариот, состоит из линейной, а не кольцевой хромосомы. Помимо линейной хромосомы, виды Borrelia содержат 7-21 плазмиду, некоторые линейные, а некоторые кольцевые. Плазмиды содержат большинство генов, необходимых для адаптации хозяина и вирулентности, а кольцевые плазмиды, полученные из профагов, как полагают, ответственны за большую часть горизонтального потока генов между спирохетальными клетками12,13. В соответствии с ролью в адаптации хозяина, некоторые, возможно, многие или все, члены группы боррелиоза Лайма теряют плазмиды в культуре14. Наиболее изученный «адаптированный к лаборатории» штамм B. burgdorferi, B31, имеет только семь из девяти плазмид, обнаруженных в диких изолятах этого вида15. Точно так же B. garinii теряет плазмиды в культуре16. Некоторые исследования показали, что виды RF и B. miyamotoi сохраняют плазмиды при культивировании14,17, но недавняя работа демонстрирует измененные плазмиды и инфекционность при длительном культивировании in vitro 18.

Методы, основанные на культуре, остаются золотым стандартом для лабораторного выявления бактериальных инфекций, как для исследований, так и для клинической работы14,17. Культура патогенов из биологических жидкостей или тканей непосредственно обнаруживает реплицирующиеся патогены и предоставляет исходный материал для исследований14,17. Этот протокол демонстрирует методологию и рецепты, необходимые для успешного культивирования спирохет группы LB, а также RF Borrelia и B. miyamotoi. Основной средой для выращивания спирохет Borrelia является среда Барбура-Штеннера-Келли (BSK-II или коммерчески доступный BSK-H) с антибиотиками или без них, чтобы уменьшить рост загрязняющих прокариот. Эта среда была адаптирована из среды, первоначально использовавшейся для поддержки RF Borrelia19, в дальнейшем модифицированной Stoenner20, а затем Barbour21. С тех пор было разработано множество модификаций, каждая из которых оказывает влияние на физиологию бактерий, что может влиять на рост, инфекционность и патогенность22. Эта среда надежно поддерживает рост спирохет в устоявшихся культурах и использовалась для выделения спирохет из клещей, млекопитающих и клинических образцов23. Недавно разработанная вариация, модифицированная среда Келли-Петтенкофера (MKP), может обеспечить лучший успех изоляции, морфологию и подвижность при выделении новых изолятов Borrelia из образцов окружающей среды, когда количество спирохет, присутствующих в образце, доступном для посева культуры, низкое23,24. Во всех случаях успех выращивания критически зависит от свежеприготовленной среды и использования соответствующих ингредиентов; Не все коммерческие ингредиенты производят высококачественную среду. Инокулированные культуры можно удобно инкубировать без встряхивания в обычном инкубаторе с температурой 32-34 °C в присутствии небольшого количества остаточного кислорода окружающей среды. Спирохеты Borrelia являются анаэробами, но по своей природе подвержены колебаниям концентрации кислорода и углекислого газа и реагируют изменениями экспрессии генов26,27,28,29. Таким образом, экспрессия генов, рост и другие метаболические исследования должны контролировать уровни кислорода и углекислого газа с использованием кислородно-контролируемого инкубатора или анаэробной камеры. В культуре культуры проверяют еженедельно или чаще на наличие спирохет либо с помощью темнопольной микроскопии, либо с помощью фазово-контрастной микроскопии. Мазки культуры могут быть окрашены либо серебристыми пятнами, иммуногистохимией, либо с помощью флуоресцентно меченных штаммов29,30. ПЦР с последующим секвенированием ДНК является чувствительным и специфическим методом обнаружения и генетической идентификации или подтверждения видов Borrelia 30,31,32,33.

Существует множество незначительных вариаций BSK-II, и некоторые из них коммерчески доступны. Протокол, описанный здесь в разделе 1, был адаптирован из Barbour (1984)21. Жидкая среда МКП является более недавно разработанной средой и описана в разделе 2. Его готовят в соответствии с ранее опубликованным протоколом33,34, который, как и среда BSK, состоит из двух этапов: приготовления основной среды и подготовки полной среды. Питательная среда Borrelia может быть приготовлена с антибиотиками или без них, как описано в разделе 3; антибиотики действуют для уменьшения количества загрязняющих бактерий, вводимых при инокуляции клинических образцов или образцов окружающей среды, как описано в разделе 4; при инокуляции чистой культурой Borrelia sp. антибиотики могут не понадобиться. Создание долгосрочных запасов боррелий часто имеет важное значение, и протокол для этого описан в разделе 5. В разделе 6 описывается использование этих сред для выделения чистых клонов Borrelia sensu lato из клинических образцов или образцов окружающей среды. Возможны несколько подходов36; Ниже приведен один из них, признанный эффективным. Гальваническая среда, используемая в этом протоколе, представляет собой модификацию гальванической средыBSK-II 37 и средыMKP 34 (с крольчатиной сывороткой, увеличенной до 10%38).

Protocol

Все исследования с участием образцов, полученных от человека, были одобрены Институциональным наблюдательным советом соответствующего университета и/или медицинского учреждения, и до того, как образцы были собраны, от участников было получено письменное информированное согласие. Вс?…

Representative Results

Питательные среды для боррелий BSK и MKP, а также варианты, представляют собой богатые питательные среды с ингредиентами, которые необходимо готовить и стерилизовать последовательно. При правильном приготовлении среда BSK должна быть красно-оранжевой и прозрачной (рис. 1</str…

Discussion

Лабораторная культура бактерий является плацдармом для исследований. Глубокое преимущество, обеспечиваемое способностью культивировать, иллюстрируется борьбой, которая на протяжении более чем столетия завершилась лишь недавним успехом, за культивирование бледной трепонемы, с?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была частично поддержана Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады и Канадским фондом болезни Лайма (AB и VL), Шведским исследовательским советом (SB, M-LF и IN), ПРОЕКТОМ TAČR GAMA 2 – «Поддержка верификации потенциала применения 2.0 в Биологическом центре CAS» (TP01010022) (MG и NR), а также грантом Министерства здравоохранения Чешской Республики NV19-05-00191 (MG и NR). Мы благодарим S. Vranjes (2021, лаборатория Руденко) за изображение на рисунке 4 и J. Thomas-Ebbett (2021, лаборатория Ллойда) за изображения на рисунке 5. Мы благодарим всех исследователей, которые внесли свой вклад в эту область, и приносим извинения тем, чьи работы мы не смогли процитировать из-за нехватки места.

Materials

1.7 mL tubes VWR 87003-294 Standard item – any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter  VWR 28145-501 Standard item – any supplier will do
10 µL barrier pipette tip Neptune BT10XLS3 Standard item – any supplier will do
10 mL Serological pipettes  Celltreat 229011B Standard item – any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip Neptune BT1000.96 Standard item – any supplier will do
15 mL tube Celltreat 188261 Standard item – any supplier will do
20 µL barrier pipette tip Neptune BT20 Standard item – any supplier will do
20 mL Sterile syringe  BD 309661 Standard item – any supplier will do
200 µL barrier pipette tip Neptune BT200 Standard item – any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes Fisher Scientific 14-933C Standard item – any supplier will do
25 mL Serological pipettes Celltreat 229025B Standard item – any supplier will do
3 mL Sterile syringe BD 309657 Standard item – any supplier will do
35% BSA  Sigma A-7409 Source is important – see note
5 mL Serological pipettes  Celltreat 229006B Standard item – any supplier will do
50 mL tube Celltreat 229421 Standard item – any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes  Schott Schott Nr. 26 135 115 Standard item – any supplier will do
Amikacine Sigma PHR1654 Standard item – any supplier will do
Amphotericin B Sigma A9528-100MG Standard item – any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole Sigma PHR1126-1G Standard item – any supplier will do
BBL Brucella broth  BD 211088 Standard item – any supplier will do
Biosafety Cabinet Labconco 302419100 Standard item – any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top – ACD) Fisher Scientific BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) Standard item – any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]  Darlynn biologicals BB83-500 Standard item – any supplier will do
centrifuge  Eppendorf model 5430 Standard item – any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate Sigma C-8532 100 g Standard item – any supplier will do
CMRL Gibco BRL 21540 500 mL Standard item – any supplier will do
CMRL-1066 Gibco 21-510-018 Standard item – any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene) Fisher Scientific 5000-0020 Standard item – any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm Sigma P7741 Standard item – any supplier will do
Digital Incubator VWR model 1545 Standard item – any supplier will do
DMSO ThermoFisher D12345 Standard item – any supplier will do
Filters for filter sterilization Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane SCGPU05RE Standard item – any supplier will do
Gelatin Difco BD 214340 500 g Standard item – any supplier will do
Glass Culture Tubes Fisher Scientific 99449-20 Standard item – any supplier will do
Glucose Sigma G-7021 1 kg Standard item – any supplier will do
Glycerol Sigma G5516 Standard item – any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) Labwissen Model 3220 Standard item – any supplier will do
HEPES Sigma  H-3784 100 g Standard item – any supplier will do
N-acetylglucoseamine Sigma  A-3286 25 g Standard item – any supplier will do
Neopeptone Difco  BD 211681 500 g Standard item – any supplier will do
Neubauer Hematocytometer Sigma  Z359629 Standard item – any supplier will do
Phase contrast microscope  Leitz Standard item – any supplier will do
Phosphomycin Sigma P5396-1G Standard item – any supplier will do
Phosphomycine Sigma P5396 Standard item – any supplier will do
Pipetboy Integra Standard item – any supplier will do
Precision Standard Balance OHAUS model TS200S Standard item – any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt) Sigma P-8574 25 g Standard item – any supplier will do
Rabbit Serum  Gibco 16-120-032 Source is important 
Rabbit Serum  Sigma R-4505  100 mL Source is important 
Rifampicin Sigma R3501-1G Standard item – any supplier will do
Sodium bicarbonate Sigma S-5761     500 g Standard item – any supplier will do
Sufametaxazole  Sigma PHR1126 Standard item – any supplier will do
TC Yeastolate Difco  BD 255752 100 g Standard item – any supplier will do
Transfer Pipettes VWR 470225-044 Standard item – any supplier will do
Trimethoprim Sigma PHR1056 Standard item – any supplier will do
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aberer, E., Duray, P. H. Morphology of Borrelia burgdorferi: Structural patterns of cultured borreliae in relation to staining methods. Journal of Clinical Microbiology. 29 (4), 764-772 (1991).
  2. Estrada-Peña, A., Cabezas-Cruz, A. Phyloproteomic and functional analyses do not support a split in the genus Borrelia (phylum Spirochaetes). BMC Evolutionary Biology. 19 (1), 54 (2019).
  3. Parte, A. C., Carbasse, J. S., Meier-Kolthoff, J. P., Reimer, L. C., Göker, M. List of prokaryotic names with standing in nomenclature (LPSN) moves to the DSMZ. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (11), 5607-5612 (2020).
  4. . List of prokaryotic names with standing in nomenclature Genus Borrelia Available from: https://lpsn.dsmz.de/gnus/borrelia (2022)
  5. Margos, G., et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 13 (12), 0208432 (2018).
  6. Gupta, R. S., et al. Distinction between Borrelia and Borreliella is more robustly supported by molecular and phenotypic characteristics than all other neighbouring prokaryotic genera: Response to Margos’ et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 14 (12), 0221397 (2019).
  7. Barbour, A. G., Qiu, W., Trujillo, S., Dedysh, P., DeVos, B., Hedlund, P., Kampfer, F. A., Rainey, W. B., Whitman, Borreliella. Bergey’s Manual of Systematics of Archaea and Bacteria. , 1-22 (2019).
  8. Rudenko, N., Golovchenko, M., Kybicova, K., Vancova, M. Metamorphoses of Lyme disease spirochetes: Phenomenon of Borrelia persisters. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-10 (2019).
  9. Strnad, M., et al. Nanomechanical mechanisms of Lyme disease spirochete motility enhancement in extracellular matrix. Communications Biology. 4 (1), 268 (2021).
  10. Niddam, A. F., et al. Plasma fibronectin stabilizes Borrelia burgdorferi-endothelial interactions under vascular shear stress by a catch-bond mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (17), 3490-3498 (2017).
  11. Anderson, C., Brissette, C. A. The brilliance of Borrelia: Mechanisms of host immune evasion by Lyme disease-causing Spirochetes. Pathogens. 10 (3), 1-17 (2021).
  12. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
  13. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 409-454 (2021).
  14. Lopez, J. E., et al. Relapsing fever spirochetes retain infectivity after prolonged in vitro cultivation. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 8 (6), 813-820 (2008).
  15. Schwan, T. G., Burgdorfer, W., Garon, C. F. Changes in infectivity and plasmid profile of the Lyme disease spirochete, Borrelia Burgdorferi, as a result of in vitro cultivation. Infection and Immunity. 56 (8), 1831-1836 (1988).
  16. Biškup, U. G., Strle, F., Ružić-Sabljić, E. Loss of plasmids of Borrelia burgdorferi sensu lato during prolonged in vitro cultivation. Plasmid. 66 (1), 1-6 (2011).
  17. Gilmore, R. D., et al. Borrelia miyamotoi strain LB-2001 retains plasmids and infectious phenotype throughout continuous culture passages as evaluated by multiplex PCR. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (1), 101587 (2021).
  18. Krishnavajhala, A., Armstrong, B. A., Lopez, J. E. The impact of in vitro cultivation on the natural life cycle of the tick-borne relapsing fever spirochete Borrelia turicatae. PLoS One. 15 (10), 0239089 (2020).
  19. Kelly, R. Cultivation of Borrelia hermsi. Science. 173 (3995), 443-444 (1971).
  20. Stoenner, H. G. Biology of Borrelia hermsii in Kelly Medium. Applied Microbiology. 28 (4), 540-543 (1974).
  21. Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale Journal of Biology and Medicine. 57 (4), 521-525 (1984).
  22. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  23. Pollack, R. J., Telford, S. R., Spielman, A. Standardization of medium for culturing Lyme disease spirochetes. Journal of Clinical Microbiology. 31 (5), 1251-1255 (1993).
  24. Ružiæ-Sabljiæ, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622 (2017).
  25. Ružić-Sabljić, E., et al. Comparison of isolation rate of Borrelia burgdorferi sensu lato in two different culture media, MKP and BSK-H. Clinical Microbiology and Infection. 20 (7), 636-641 (2014).
  26. Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
  27. Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
  28. Raffel, S. J., Williamson, B. N., Schwan, T. G., Gherardini, F. C. Colony formation in solid medium by the relapsing fever spirochetes Borrelia hermsii and Borrelia turicatae. Ticks and Tick-borne Diseases. 9 (2), 281-287 (2018).
  29. Margos, G., et al. Long-term in vitro cultivation of Borrelia miyamotoi. Ticks and Tick-borne Diseases. 6 (2), 181-184 (2015).
  30. Middelveen, M. J., et al. Culture and identification of Borrelia spirochetes in human vaginal and seminal secretions. F1000Research. 3, 309 (2014).
  31. Moriarty, T. J., et al. Real-time high resolution 3D imaging of the Lyme disease spirochete adhering to and escaping from the vasculature of a living host. PLoS Pathogens. 4 (6), 1000090 (2008).
  32. Cerar, T., Korva, M., Avšič-Županc, T., Ružić-Sabljić, E. Detection, identification and genotyping of Borrellia spp. In rodents in Slovenia by PCR and culture. BMC Veterinary Research. 11, 188 (2015).
  33. Liebisch, G., Sohns, B., Bautsch, W. Detection and typing of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus ticks attached to human skin by PCR. Journal of Clinical Microbiology. 36 (11), 3355-3358 (1998).
  34. Ružić-Sabljić, E., Strle, F. Comparison of growth of Borrelia afzelii, B. gavinii, and B. burgdorferi sense strict in MKP and BSK-II medium. International Journal of Medical Microbiology. 294 (6), 407-412 (2004).
  35. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Schierz, G. European Borrelia burgdorferi isolated from humans and ticks culture conditions and antibiotic susceptibility. Zentralblatt fur Bakteriologie Mikrobiologie und Hygiene. Series A, Medical Microbiology, Infectious Diseases, Virology, Parasitology. 263 (1-2), 112-118 (1986).
  36. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Reinhardt, S. Culture of Borrelia burgdorferi on six solid media. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (12), 1076-1079 (1991).
  37. Rosa, P. A., Hogan, D. Colony formation by Borrelia burgdorferi in solid medium: clonal analysis of osp locus variants. First International Conference on Tick Borne Pathogens at the Host-Vector Interface: An Agenda for Research. , 95-103 (1992).
  38. Wagemakers, A., Oei, A., Fikrig, M. M., Miellet, W. R., Hovius, J. W. The relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi is cultivable in a modified Kelly-Pettenkofer medium, and is resistant to human complement. Parasites and Vectors. 7 (1), 4-9 (2014).
  39. Oliver, J. H., et al. First isolation and cultivation of Borrelia burgdorferi sensu lato from Missouri. Journal of Clinical Microbiology. 36 (1), 1-5 (1998).
  40. Greenfield, E. A. Myeloma and hybridoma cell counts and viability checks. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), 689-690 (2019).
  41. Baradaran-Dilmaghani, R., Stanek, G. In vitro susceptibility of thirty borrelia strains from various sources against eight antimicrobial chemotherapeutics. Infection. 24 (1), 60-63 (1996).
  42. Ružić-Sabljić, E., Podreka, T., Maraspin, V., Strle, F. Susceptibility of Borrelia afzelii strains to antimicrobial agents. International Journal of Antimicrobial Agents. 25 (6), 474-478 (2005).
  43. Sicklinger, M., Wienecke, R., Neubert, U. In vitro susceptibility testing of four antibiotics against Borrelia burgdorferi: A comparison of results for the three genospecies Borrelia afzelii, Borrelia garinii, and Borrelia burgdorferi sensu stricto. Journal of Clinical Microbiology. 41 (4), 1791-1793 (2003).
  44. Edmondson, D. G., Hu, B., Norris, S. J. Long-term in vitro culture of the syphilis spirochete treponema pallidum subsp. Pallidum. mBio. 9 (3), 01153 (2018).
  45. Wilhelmsson, P., et al. Prevalence and diversity of Borrelia species in ticks that have bitten humans in Sweden. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 4169-4176 (2010).
  46. Toledo, A., et al. Phylogenetic analysis of a virulent Borrelia species isolated from patients with relapsing fever. Journal of Clinical Microbiology. 48 (7), 2484-2489 (2010).
  47. Elbir, H., et al. Genome sequence of the Asiatic species Borrelia persica. Genome Announcements. 2 (1), 01127 (2014).
  48. Sapi, E., et al. Improved culture conditions for the growth and detection of Borrelia from human serum. International Journal of Medical Sciences. 10 (4), 362-376 (2013).
  49. Liveris, D., et al. Quantitative detection of Borrelia burgdorferi in 2-millimeter skin samples of erythema migrans lesions: Correlation of results with clinical and laboratory findings. Journal of Clinical Microbiology. 40 (4), 1249-1253 (2002).
  50. Wormser, G. P., et al. Comparison of the yields of blood cultures using serum or plasma from patients with early Lyme disease. Journal of Clinical Microbiology. 38 (4), 1648-1650 (2000).
  51. Lagal, V., Postic, D., Ruzic-Sabljic, E., Baranton, G. Genetic diversity among Borrelia strains determined by single-strand conformation polymorphism analysis of the ospC gene and its association with invasiveness. Journal of Clinical Microbiology. 41 (11), 5059-5065 (2003).
  52. Lin, Y. P., Diuk-Wasser, M. A., Stevenson, B., Kraiczy, P. Complement evasion contributes to Lyme Borreliae-host associations. Trends in Parasitology. 36 (7), 634-645 (2020).
  53. Real-time PCR: understanding Ct. Application Note Real-time PCR. Thermo Fisher Scientific Inc Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/PG1503-PJ9169-CO019879-Re-brand-Real-Time-PCR-Undertanding-Ct-Value-Americas-FHR.pdf (2016)
  54. Adams, B., Walter, K. S., Diuk-Wasser, M. A. Host specialisation, immune cross-reaction and the composition of communities of co-circulating Borrelia strains. Bulletin of Mathematical Biology. 83 (6), 66 (2021).
  55. Marosevic, D., et al. First insights in the variability of Borrelia recurrentis genomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (9), 0005865 (2017).
  56. Koetsveld, J., et al. Development and optimization of an in vitro cultivation protocol allows for isolation of Borrelia miyamotoi from patients with hard tick-borne relapsing fever. Clinical Microbiology and Infection. 23 (7), 480-484 (2017).
  57. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16 (2020).
  58. Replogle, A. J., et al. Isolation of Borrelia miyamotoi and other Borreliae using a modified BSK medium. Scientific Reports. 11 (1), 1926 (2021).
  59. Stanek, G., Reiter, M. The expanding Lyme Borrelia complex-clinical significance of genomic species. Clinical Microbiology and Infection. 17 (4), 487-493 (2011).
  60. Seifert, S. N., Khatchikian, C. E., Zhou, W., Brisson, D. Evolution and population genomics of the Lyme borreliosis pathogen, Borrelia burgdorferi. Trends in Genetics. 31 (4), 201-207 (2015).
  61. Kurokawa, C., et al. Interactions between Borrelia burgdorferi and ticks. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 587-600 (2020).
  62. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 473-518 (2021).
  63. Wolcott, K. A., Margos, G., Fingerle, V., Becker, N. S. Host association of Borrelia burgdorferi sensu lato: A review. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (5), 101766 (2021).
  64. Thompson, D., Watt, J. A., Brissette, C. A. Host transcriptome response to Borrelia burgdorferi sensu lato. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (2), 101638 (2021).
  65. Chaconas, G., Moriarty, T. J., Skare, J., Hyde, J. A. Live imaging. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 385-408 (2021).
  66. Kerstholt, M., Netea, M. G., Joosten, L. A. B. Borrelia burgdorferi hijacks cellular metabolism of immune cells: Consequences for host defense. Ticks and Tick-borne Diseases. 11 (3), 101386 (2020).
  67. Rudenko, N., Golovchenko, M. Sexual transmission of Lyme Borreliosis? The question that calls for an answer. Tropical Medicine and Infectious Disease. 6 (2), 87 (2021).
  68. Cutler, S. J., et al. Diagnosing Borreliosis. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 17 (1), 2-11 (2017).
  69. Middelveen, M. J., et al. Persistent Borrelia infection in patients with ongoing symptoms of Lyme disease. Healthcare. 6 (2), 33 (2018).
  70. Bernard, Q., Grillon, A., Lenormand, C., Ehret-Sabatier, L., Boulanger, N. Skin Interface, a key player for Borrelia multiplication and persistence in Lyme Borreliosis. Trends in Parasitology. 36 (3), 304-314 (2020).
  71. Bobe, J. R., et al. Recent progress in Lyme disease and remaining challenges. Frontiers in Medicine. 8, 666554 (2021).
  72. Branda, J. A., Steere, A. C. Laboratory diagnosis of lyme borreliosis. Clinical Microbiology Reviews. 34 (2), 1-45 (2021).

Tags

SpirochetesBorrelia BurgdorferiRelapsing Fever BorreliaBorrelia MiyamotoiCultureBSK-II MediumBacterial GrowthRabbit SerumGelatinAnaerobic AtmosphereIncubation Temperature

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Berthold, A., Faucillion, M., Nilsson, I., Golovchenko, M., Lloyd, V., Bergström, S., Rudenko, N. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp. (189), e64431, doi:10.3791/64431 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image