קביעת העדפת טמפרטורה של יתושים ואקטותרמיות אחרות
Summary
לחרקים יש טווח טמפרטורות סביבתי אופטימלי שהם מבקשים להישאר בתוכו, וגורמים חיצוניים ופנימיים רבים יכולים לשנות העדפה זו. כאן אנו מתארים שיטה חסכונית ופשוטה לחקר בחירת הטמפרטורה, המאפשרת לחרקים להפגין בחופשיות את התנהגותם הטבעית.
Abstract
לרוב החרקים והאקטותרמיות האחרות יש חלון טמפרטורה אופטימלי צר יחסית, ולסטייה מהאופטימה שלהם יכולה להיות השפעה משמעותית על כושרם, כמו גם על מאפיינים אחרים. כתוצאה מכך, ectotherms רבים כאלה מחפשים את טווח הטמפרטורות האופטימלי שלהם. למרות שהעדפות הטמפרטורה של יתושים וחרקים אחרים נחקרו היטב, מערך הניסוי המסורתי מבוצע באמצעות שיפוע טמפרטורה על משטח אלומיניום בחלל סגור מאוד. במקרים מסוימים, ציוד זה מגביל התנהגויות טבעיות רבות, כגון טיסה, אשר עשויות להיות חשובות בבחירת העדפות.
מטרת מחקר זה היא לבחון את העדפת החרקים לטמפרטורת האוויר באמצעות מנגנון דו-תאי עם מספיק מקום לטיסה. שני התאים מורכבים מאינקובטורים עצמאיים מבוקרי טמפרטורה, שלכל אחד מהם מפתח צמצם גדול. האינקובטורים מחוברים על ידי פתחים אלה באמצעות גשר אקרילי קצר. בתוך האינקובטורים נמצאים שני כלובי רשת, המחוברים דרך הפתחים והגשר, ומאפשרים לחרקים לעוף בחופשיות בין התנאים השונים. הגשר האקרילי משמש גם כשיפוע טמפרטורה בין שני האינקובטורים.
בשל השטח המרווח בכלוב והבנייה הקלה, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור כל ectotherm קטן ו / או כל מניפולציה שעשויה לשנות את העדפות הטמפרטורה כולל מניפולציה של איברי החושים, תזונה, פלורת מעיים ונוכחות אנדוסימביונטית ברמות בטיחות ביולוגית 1 או 2 (BSL 1 או 2). בנוסף, המנגנון יכול לשמש לחקר זיהום פתוגן באמצעות הכלה נוספת (למשל, בתוך ארון בטיחות ביולוגית) ב- BSL 3.
Introduction
אורגניזמים יכולים לחיות ולהתרבות רק בטווח הסבילות התרמית שלהם. מכיוון שטמפרטורת הסביבה משתנה עקב חילופי העונות וההתחממות הגלובלית, מינים חייבים להסתגל ולהגיב בהתאם כדי להבטיח את הישרדותם. זה כולל ectotherms, שבו טמפרטורת הגוף היא בשיווי משקל עם הסביבה1. לפיכך, לכל חרק יש טווח טמפרטורות סביבתי אופטימלי משלו אשר הם מבקשים להישאר בתוך2.
טמפרטורה היא אחד הגורמים החשובים המשמשים לחיזוי התפוצה והטווח של חרקים 3,4,5, תוך התבוננות ביחסי פתוגן-חרקים6,7 והשפעתם של גורמים חיצוניים על כושרם של אקטותרמים כגון תוחלת החיים הבוגרת שלהם, fecundity, ושיעור האכלה 8,9.
מחקרים קודמים חקרו את הטמפרטורה המועדפת של ectotherms עם הגדרות שונות. הנפוץ ביותר הוא שימוש בבלוק אלומיניום גדול עם אמבט מים מקורר או מחומם 10, אמבט קרח ואלמנט חימוםהניתן לתכנות 11, צלחות קרות וחמות12,13, צלחות וסת תרמי 14,15, או חבילת חום וקרח 16 בשני הקצוות ליצירת שיפוע טמפרטורה. בנוסף, מחקרים אחרים השתמשו גם בחממה הדרגתית לטמפרטורה כדי לחקור את הצמיחה של חיידקים נבחרים17 והרכיבו מוט אלומיניום על מכשיר תרמואלקטרי (מחומם ומקורר בקצוות) כדי לבחון את ההעדפה התרמית של Drosophila melanogaster18,19.
עם זאת, למתודולוגיה החלופית המוצעת כאן יש יתרונות משמעותיים עבור יישומי חרקים מסוימים. ראשית, פתרונות אחרים דורשים בנייה מלאה מאפס עם חומרים בסיסיים, כולל יריעות אלומיניום, בניית תאי אקריליק לחרקים, ולעתים קרובות מערך מצלמה ותוכנה מומחית; הגדרה זו עלולה להיות יקרה ולגזול זמן רב. שנית, מנגנונים חלופיים רבים מסתמכים על שיפוע טמפרטורה על משטח (בניגוד לטמפרטורת האוויר). כתוצאה מכך, החדר שבו נחקרים החרקים הוא לעתים קרובות צר מאוד (למשל, שיפועים באורך 24 ס”מ עם רוחב של 2 ס”מ בלבד ועומקשל 16 ס”מ בלבד), מה שעשוי למנוע התנהגויות טבעיות, כגון מעוף, שהן חיוניות לתנועתיות תקינה של חרקים ולכן הכרחיות בבחירת טמפרטורה מועדפת. חלק מהמחקרים אכן מודדים את טמפרטורת האוויר; עם זאת, הניקוד של הבחירה עדיין כרוך בספירת מספר היתושים הנוחתים על יסודות פלטייה בניגוד לחרקים המעופפים בחופשיות בכלובים20.
במחקר זה אנו מתארים מערך פשוט יותר, המשתמש בציוד סטנדרטי בעל שינוי מינימלי ומספק לחרקים מספיק מקום לעוף ולנווט יחסית באין מפריע בכלוב תחזוקה של מושבה בגודל סטנדרטי. יתר על כן, במקום להסתמך על שיפוע, הפרוטוקול משתמש בשני חלקים גדולים יחסית של טמפרטורה פנימית עקבית, המאפשרת נדידה טבעית של החרקים בטמפרטורה המועדפת עליהם וניקוד בינארי פשוט. לפיכך, המנגנון והפרוטוקול המתוארים כאן מספקים אמצעי זול ופשוט לחקר העדפת טמפרטורת היתושים בסביבה פחות חסימתית ויותר מציאותית.
הפרוטוקול כולל הכנה של החרקים לפני הניסוי ואחריו מערך המנגנון הדו-תאי. צעדים נוספים כוללים הצבת חרקים במנגנון כדי לאפשר את בחירת הטמפרטורה וניקוד התוצאות. להמחשה של השיטה כאן, בחרנו את הטמפרטורה האופטימלית (גידול סטנדרטי) של החרקים, 27 °C עבור Aedes aegypti, 25 °C עבור Drosophila melanogaster, וטמפרטורת דוחה גבוהה יותר עבור שני מיני החרקים, 30 °C (50 °F) ו 28 °C (78 °F), בהתאמה. חרקים מקבלים 30 דקות כדי לבחור חדר מועדף. זמן זה נמצא מספיק, ומשך זמן ארוך יותר לא שינה את התוצאות; עם זאת, ניתן להרחיב זאת בהתאם למין/טמפרטורה/משתנים אחרים לפי הצורך.
Protocol
Representative Results
Discussion
המחקר מתאר שיטה חדשה לבחון את העדפת הטמפרטורה אצל יתושים. בשיטה זו, יתושים משוחררים לתוך צינור המחובר לשני אינקובטורים עם טמפרטורות שליטה עצמאית. באופן זה, היתושים רשאים לבחור באופן חופשי בין שתי טמפרטורות מבלי לשבש את התנהגותם הטבעית ואת מנגנון הביטוי שלהם (למשל, טיסה).
הניסוי המייצג הראשון שלנו השתמש בטמפרטורה אופטימלית של 27 מעלות צלזיוס בשני החדרים. במהלך החזרות על ניסוי זה, יתושים נצפו מעופפים בחופשיות בין שני הכלובים במשך כל 30 הדקות, ובכל ההעתקים היו מספרים כמעט שווים בכל אחד משני התאים. זה אישר את כוונת הניסוי לאפשר ליתושים את היכולת לבחור באופן חופשי בין כלובים תוך הפגנת התנהגותם הטבעית (מעופפים). לעומת זאת, הניסוי הייצוגי השני השתמש בטמפרטורה האופטימלית האטרקטיבית של 27 מעלות צלזיוס בתא אחד ובטמפרטורה תת-אופטימלית ולכן דוחה של 30 מעלות צלזיוס בתא השני. כצפוי, יתושים בחרו בעקביות את תא הטמפרטורה האופטימלי במשמעות גבוהה, גם כאשר החלפנו את האינקובטורים כדי למנוע הטיה.
בדקנו גם את ההתקנה של חרק אחר, D. melanogaster (זבובי פירות), המייצג אורגניזם מודל אקטותרמי אחר. תא אחד נקבע לטמפרטורה האופטימלית של D. melanogaster, 25 °C, והשני נקבע ל -3 °C גבוה יותר, 28 °C (78 °F). בדומה ליתושים, גם זבובי הפירות העדיפו את הטמפרטורה האופטימלית שלהם ונמנעו מהתא החם יותר. זה מוכיח כי הפרוטוקול מתאים למגוון של ectotherms.
תיאור השלבים הקריטיים בפרוטוקול
השלב הקריטי העיקרי בפרוטוקול הוא טיפול בחרקים, שכן הוא יוצר אפשרות לבריחת חרקים. ניתן למנוע זאת על ידי קביעה כי אין חורים גדולים מספיק לבריחה בכלובים המשמשים, כי הגומי/אזיקוני הכבלים המשמשים לאבטחת שרוולי הרשת לגשר הדוקים, וכי הכיסוי לחור החדרת החרקים בגשר מחובר ואטום היטב.
כמו כן, חיוני לוודא שחרקים לא בורחים לפני או אחרי הניסוי, במיוחד כאשר החרקים נדרשים לניסויים במורד הזרם או לנקודות זמן מאוחרות יותר לבחירות טמפרטורה שונות. ניתן לעשות זאת על ידי הרדמת החרקים לפני הצבתם בגשר האקרילי (שימוש בקרח עבור Drosophila ו- CO 2 עבור יתושים) ושחרור CO2 לתוך הגשר כדי להפיל את החרקים לאחר הניסויים, לפני החישוב. השימוש ב-CO2 הוא אידיאלי ליתושים מכיוון שהוא לא ישפיע על התוצאות ההתנהגותיות21. בזבובים, חשיפה ל-CO2 יכולה לשנות את התנהגותם המעופפת23, ולכן מומלץ להשתמש בקרח22.
ספירת חרקים היא גם צעד קריטי, כדי להבטיח שמספר החרקים יהיה שווה לפני ואחרי הניסוי לקבלת תוצאות מדויקות. על מנת לעשות זאת, אנו ממליצים על שימוש בעט CO2 לאחר השלמת הניסוי כדי להפיל את החרקים הנמצאים בגשר. זה יעזור להזיז את החרקים לשני צדי החדר, ובכך להפחית את מספר הנמלטים. אנו גם מדגישים בפרוטוקול כי חרקים יכולים להיתפס בשרוולים של הכלובים במהלך הפרדת כלובים; לכן, ודא שהם נבדקים ביסודיות במהלך הספירה.
שינויים פוטנציאליים ופתרון בעיות של הטכניקה
הקושי העיקרי בטכניקה זו הוא הרשת הגמישה של שרוולי הכלוב וכתוצאה מכך רווחים או מקומות מסתור ומכאן בריחת חרקים או לכידה. ישנם כמה שינויים פוטנציאליים, במידת הצורך, כדי לשפר את הטכניקה. אנו מציעים להשתמש בשתי גומיות או יותר כדי להבטיח שהגשר מאובטח כראוי בין התאים מבלי להשאיר מקום פוטנציאלי לחרקים (רשת רופפת יוצרת מקום מסתור לחרקים). אנו ממליצים גם להקפיד במיוחד למשוך את שרוול הרשת מתוח, כמתואר בשלב 2.6, בעת הרכבת המנגנון.
אינקובטורים בעלי גורם צורה קטן מחוממים בדרך כלל בלבד (כלומר, אין להם קירור פעיל), כפי שהיה במקרה של האינקובטורים המשמשים כאן. כתוצאה מכך, שימוש בטמפרטורות סביב או מתחת לטמפרטורת החדר בסביבה יחייב את הניסוי להתבצע בחדר קר כדי להבטיח שהטמפרטורות שנקבעו לאינקובטורים יהיו נמוכות ככל הרצוי.
בנוסף, הגדרה זו יכולה לשמש גם עבור BSL 3, שבו ארון biosafety בכיתה שלוש (תא כפפות) יש צורך. במקרה זה, תא הכפפות צריך להיות גדול מספיק כדי להתאים את כל המנגנון. הניסוי המתואר בפרוטוקול זה אידיאלי לניסויים בתא כפפות מכיוון שכל מה שיידרש ייכלל בתוך תא הכפפות, וחשוב מכך, האפשרות של חרקים לברוח היא מינימלית.
לבסוף, יש מספיק מקום באינקובטורים כדי להוסיף אור חיצוני או מקור לחות מבלי להשפיע על החרקים בכלובים. בהתאם למין החרקים או לתכנון הניסוי, מנורת LED בעובי 1 ס”מ יכולה להיות ממוקמת בקלות על גבי הכלוב בתוך אינקובטורים אחד או שניהם. אספקת אור לשניהם והצעת בחירת טמפרטורה יכולה להיות פרוטוקול מציאותי יותר עבור כמה עיצובים ניסיוניים רגישים לאור, או רק מתן אור (או לחות) לתא אחד הוא שינוי אפשרי לפרוטוקול כדי להעריך את בחירת האור / לחות.
היתרונות של טכניקה זו בהקשר של מבחני העדפת טמפרטורה בחירה כפולה
השיטה המתוארת כאן מציגה חלופה לשיטת שיפוע הטמפרטורה המסורתית שתוארה במחקרים קודמים10,13,14,16. ברוב המחקרים הללו נעשה שימוש בבלוק אלומיניום אופקי גדול עם שיפוע תרמי, בעוד שמנגנון יצירת שיפוע זה משתנה, כולל בלוקי חימום/קירור, אמבטיות מים וכו’. במקרים אלה, שיפוע הטמפרטורה מיוצר על פני גוש האלומיניום (ולא על טמפרטורת האוויר בכלוב). כתוצאה מכך, רוב (אך לא כל) הטכניקות החלופיות אכן מגבילות את יכולת המעוף של חרקים יותר מפרוטוקול זה. כאן, חרקים יכולים לעוף בחופשיות יחסית בין כלובים, מה שמאפשר ביטוי מציאותי יותר של התנהגויות טבעיות בבחירה. אפשר יהיה אפילו להרחיב את המנגנון הניסיוני הזה באמצעות כלובים ואינקובטורים גדולים יותר, למשל, עבור חרקים גדולים יותר.
בנוסף ליתרון ההתנהגות הטבעית, אנו גם מפגינים אחידות טמפרטורה גבוהה מאוד בתוך שני התאים, מה שמאפשר ניקוד פשוט ובחירה ברורה של שני תאי טמפרטורה בודדים גדולים. שימוש בעיצוב בינארי של תא גדול כגון זה עשוי להפחית את הרעש בנתונים, כאשר, למשל במנגנון גרדיאנט, כל תנועה מקרית של החרקים תשנה את מיקומם על השיפוע ומכאן העדפת הטמפרטורה הנתפסת שלהם.
הטכניקה המתוארת כאן היא גם פשוטה מאוד בעלות נמוכה. טכניקה זו אינה זקוקה למכשירים נוספים כדי לקבוע את הטמפרטורות (כלומר, אמבט מים 10 ו/או פלטה חמה 11,12,13,14,15), אין ציוד מיוחד מלבד צינור אקריליק חתוך וחורים קדוחים, ואין מצלמה 18,19 או תוכנה מתוחכמת 19 לניתוח. רכיבים כאלה המשמשים בטכניקות אחרות יכולים להיות יקרים ו/או דורשים מומחיות ובדיקות משמעותיות כדי להתחיל בניסויים.
טכניקה זו יכולה גם להיות משוכפלת עם התקנים שונים המשתמשים בסוללות אם אין ספק כוח חיצוני, מה שהופך את המערכת אידיאלית לביצוע ניסויים בשטח. יתר על כן, ניתן לשנות מעט את אותו מנגנון כדי לחקור מצבים אחרים של העדפת בחירה בינארית, כגון אור לעומת חושך, לחות גבוהה/נמוכה וכו’, במעבדה או בשדה.
המנגנון בגודל מלא בפרוטוקול קטן משמעותית מהגדרות שיפוע הטמפרטורה, מה שמאפשר התאמה קלה יותר בתוך תא כפפות BSL 3 כמתואר לעיל. יתר על כן, החרקים קלים יותר להכלה, מכיוון שניתן להפיל אותם עם CO2 בסוף הניסוי, וניתן לאטום מחדש את הכלובים במהירות לאחר הפרדה מהגשר. יתרונות הכלה אלה הם אידיאליים לעבודה עם BSL 3.
עם זאת, אנו מכירים בכך שהמנגנון שלנו מאפשר רק החלטה בינארית ולא בחירה חופשית לאורך שיפוע, אשר, בהתאם ליישום, עשוי לדרוש ריצות נוספות כדי לזהות טמפרטורות אופטימליות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AHR מודה במימון תמיכה ממג’לס אמנה רקיאט (MARA).
Materials
| Acrylic tube (Bridge) | Perspex | 900 mm OD | Size (Length x diameter): 8 cm x 9 cm; 1 cm bigger than the size of the hole in front of the incubator. Size of the hole on top: 1.6 cm |
| Carbon dioxide (CO2) inflator | Peaken | B08HM2BDDB | Any CO2 pen will work |
| Digital Incubator (×2) | VWR | VWR INCU-Line 1L 10 (390-0384) | Size of hole in front of incubator: 8 cm diameter. Holes need to be position in the center and have the same exact position on both incubators to allow alignment of bridge.This should be pre-drilled using a standard 8 cm ‘holesaw’ drill bit. Incubator must be just large enough to contain one mosquito cage. |
| Mechanical aspirator (for mosquitoes) | Watkins and Doncaster | E710 | Ideal barrel size 50 x 28 mm and tube diameter 9mm. |
| Mosquito cage (×3; two for the experiments, one for storing insects) | BugDorm | BD4S1515 | Size: 17.5 cm x 17.5 cm x 17.5 cm with 12 cm sleeve opening. Mesh material : Knitted nylon |
| Plastic funnel | Diameter of opening = 5 cm Length of funnel = 5 cm Diameter of aperture = 1 cm |
||
| Plastic Pocket Pooter (for Drosophila or small insects) | Watkins and Doncaster | E714 | Manual/mouth aspirated |
| Rubber band or Reusable cable tie | Either, depending on preference. | ||
| Temperature probe | Eidyer | B07J4T1VQZ | Any thermometer with at least 100 cm narrow wire probe |
References
- Wright, R. K., Cooper, E. L. Temperature effects on ectotherm immune responses. Developmental & Comparative Immunology. 5, 117-122 (1981).
- Deal, J. The temperature preferendum of certain insects. The Journal of Animal Ecology. 10 (2), 323-356 (1941).
- Hongoh, V., Berrang-Ford, L., Scott, M. E., Lindsay, L. R. Expanding geographical distribution of the mosquito, Culex pipiens, in Canada under climate change. Applied Geography. 33, 53-62 (2012).
- Beck-Johnson, L. M., et al. The importance of temperature fluctuations in understanding mosquito population dynamics and malaria risk. Royal Society Open Science. 4 (3), 160969 (2017).
- Erraguntla, M., et al. Predictive model for microclimatic temperature and its use in mosquito population modeling. Scientific Reports. 11 (1), 18909 (2021).
- Shapiro, L. L., Whitehead, S. A., Thomas, M. B. Quantifying the effects of temperature on mosquito and parasite traits that determine the transmission potential of human malaria. PLoS Biology. 15 (10), 20033489 (2017).
- Zhang, Y., et al. Decline in symbiont-dependent host detoxification metabolism contributes to increased insecticide susceptibility of insects under high temperature. The ISME Journal. 15 (12), 3693-3703 (2021).
- Amarasekare, P., Savage, V. A framework for elucidating the temperature dependence of fitness. The American Naturalist. 179 (2), 178-191 (2012).
- Buckley, L. B., Nufio, C. R. Elevational clines in the temperature dependence of insect performance and implications for ecological responses to climate change. Conservation Physiology. 2 (1), 035 (2014).
- MacLean, H. J., et al. Temperature preference across life stages and acclimation temperatures investigated in four species of Drosophila. Journal of Thermal Biology. 86, 102428 (2019).
- Castañeda, L. E., Romero-Soriano, V., Mesas, A., Roff, D. A., Santos, M. Evolutionary potential of thermal preference and heat tolerance in Drosophila subobscura. Journal of Evolutionary Biology. 32 (8), 818-824 (2019).
- Weldon, C. W., Terblanche, J. S., Bosua, H., Malod, K., Chown, S. L. Male Mediterranean fruit flies prefer warmer temperatures that improve sexual performance. Journal of Thermal Biology. 108, 103298 (2022).
- Sayeed, O., Benzer, S. Behavioral genetics of thermosensation and hygrosensation in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93 (12), 6079-6084 (1996).
- Verhulst, N. O., Brendle, A., Blanckenhorn, W. U., Mathis, A. Thermal preferences of subtropical Aedes aegypti and temperate Ae. japonicus mosquitoes. Journal of Thermal Biology. 91, 102637 (2020).
- Ziegler, R., Blanckenhorn, W. U., Mathis, A., Verhulst, N. O. Video analysis of the locomotory behaviour of Aedes aegypti and Ae. japonicus mosquitoes under different temperature regimes in a laboratory setting. Journal of Thermal Biology. 105, 103205 (2022).
- Blanford, S., Read, A. F., Thomas, M. B. Thermal behaviour of Anopheles stephensi in response to infection with malaria and fungal entomopathogens. Malaria Journal. 8, 72 (2009).
- Nakae, T. Temperature-related anomalies in the growth of selected bacteria. Journal of Dairy Science. 54 (12), 1780-1783 (1971).
- Rajpurohit, S., Schmidt, S. P. Measuring thermal behavior in smaller insects: A case study in Drosophila melanogaster demonstrates effects of sex, geographic origin, and rearing temperature on adult behavior. Fly. 10 (4), 149-161 (2016).
- Truitt, A. M., Kapun, M., Kaur, R., Miller, W. J. Wolbachia modifies thermal preference in Drosophila melanogaster. Environmental Microbiology. 21 (9), 3259-3268 (2019).
- Reinhold, J. M., et al. Species-specificity in thermopreference and CO2-gated heat-seeking in Culex mosquitoes. Insects. 13 (1), 92 (2022).
- Lin, C. S., Georghiou, G. P. Tolerance of mosquito larvae and pupae to carbon dioxide anesthesia. Mosquito News. 36 (4), 460-461 (1976).
- Ito, F., Awasaki, T. Comparative analysis of temperature preference behavior and effects of temperature on daily behavior in 11 Drosophila species. Scientific Reports. 12 (1), 1-15 (2022).
- Bartholomew, N., Burdett, J., VandenBrooks, J., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Scientific Reports. 5, 15298 (2015).
