Bepaling van de temperatuurvoorkeur van muggen en andere ectothermen
Summary
Insecten hebben een optimaal omgevingstemperatuurbereik waar ze binnen willen blijven, en veel externe en interne factoren kunnen deze voorkeur veranderen. Hier beschrijven we een kosteneffectieve en eenvoudige methode om temperatuurkeuze te bestuderen, waardoor insecten vrijelijk hun natuurlijke gedrag kunnen vertonen.
Abstract
De meeste insecten en andere ectothermen hebben een relatief smal optimaal temperatuurvenster en afwijking van hun optima kan aanzienlijke effecten hebben op hun fitheid, evenals andere kenmerken. Bijgevolg zoeken veel van dergelijke ectothermen naar hun optimale temperatuurbereik. Hoewel de temperatuurvoorkeuren van muggen en andere insecten goed zijn bestudeerd, wordt de traditionele experimentele opstelling uitgevoerd met behulp van een temperatuurgradiënt op een aluminium oppervlak in een zeer afgesloten ruimte. In sommige gevallen beperkt deze apparatuur veel natuurlijk gedrag, zoals vliegen, wat belangrijk kan zijn bij de voorkeursselectie.
Het doel van deze studie is om de voorkeur van insecten voor luchttemperatuur te observeren door gebruik te maken van een apparaat met twee kamers met voldoende ruimte voor vluchten. De twee kamers bestaan uit onafhankelijke temperatuurgecontroleerde incubators, elk met een groot diafragma. De incubators zijn verbonden door deze openingen met behulp van een korte acrylbrug. In de incubators bevinden zich twee netkooien, verbonden via de openingen en de brug, waardoor de insecten vrij kunnen vliegen tussen de verschillende omstandigheden. De acrylbrug fungeert ook als een temperatuurgradiënt tussen de twee incubatoren.
Vanwege de ruime ruimte in de kooi en de eenvoudige constructie, kan deze methode worden gebruikt om elke kleine ectotherm en / of manipulatie te bestuderen die de temperatuurvoorkeur kan veranderen, waaronder sensorische orgaanmanipulatie, dieet, darmflora en endosymbiont aanwezigheid bij bioveiligheidsniveaus 1 of 2 (BSL 1 of 2). Bovendien kan het apparaat worden gebruikt voor de studie van pathogene infectie met behulp van verdere inperking (bijvoorbeeld in een bioveiligheidskast) bij BSL 3.
Introduction
Organismen kunnen alleen leven en zich voortplanten binnen hun thermische tolerantiebereik. Omdat de omgevingstemperatuur varieert als gevolg van veranderende seizoenen en opwarming van de aarde, moeten soorten zich aanpassen en dienovereenkomstig reageren om hun overleving te garanderen. Dit omvat ectothermen, waarbij de lichaamstemperatuur in evenwicht is met de omgeving1. Vandaar dat elk insect zijn eigen optimale omgevingstemperatuurbereik heeft dat ze proberen binnen2 te houden.
Temperatuur is een van de belangrijke factoren die worden gebruikt om de verspreiding en het bereik van insectente voorspellen 3,4,5, het observeren van pathogeen-insectrelaties 6,7 en het effect van externe factoren op de fitheid van ectothermen zoals hun volwassen levensduur, vruchtbaarheid en voedingssnelheid 8,9.
Eerdere studies hebben de voorkeurstemperatuur van ectothermen onderzocht met verschillende opstellingen. De meest voorkomende is het gebruik van een groot aluminium blok met een gekoeld of verwarmd waterbad10, een ijsbad en programmeerbaar verwarmingselement11, koude en hete platen12,13, thermische regelaarplaten14,15 of een warmtepak en ijspak16 aan beide uiteinden om een temperatuurgradiënt te creëren. Bovendien hebben andere studies ook een temperatuurgradiëntincubator gebruikt om de groei van geselecteerde bacteriën17 te bestuderen en een aluminium staaf op een thermo-elektrisch apparaat te monteren (verwarmd en gekoeld aan de uiteinden) om de thermische voorkeur van Drosophila melanogaster18,19 te observeren.
De hier voorgestelde alternatieve methodologie heeft echter aanzienlijke voordelen voor bepaalde insectentoepassingen. Ten eerste vereisen andere oplossingen een complete constructie vanaf nul met basismaterialen, waaronder aluminiumplaten, het bouwen van acrylkamers voor de insecten en vaak een camera-opstelling en gespecialiseerde software; dit kan duur en tijdrovend zijn om in te stellen. Ten tweede vertrouwen veel alternatieve apparaten op een temperatuurgradiënt op een oppervlak (in tegenstelling tot de luchttemperatuur). Bijgevolg is de kamer waarin de insecten worden bestudeerd vaak erg smal (bijv. 24 cm lange gradiënten met slechts 2 cm breedte en 1 cm diepte16), wat natuurlijk gedrag, zoals vlucht, kan voorkomen, die essentieel zijn voor de normale mobiliteit van insecten en daarom noodzakelijk zijn bij het selecteren van een voorkeurstemperatuur. Sommige studies meten wel de luchttemperatuur; de score van keuze omvat echter nog steeds het tellen van het aantal muggen dat op de Peltier-elementen landt in tegenstelling tot insecten die vrij in de kooien vliegen20.
In deze studie beschrijven we een eenvoudigere opstelling, die minimaal aangepaste standaarduitrusting gebruikt en insecten voldoende ruimte biedt om relatief ongehinderd te vliegen en te navigeren in een standaard kolonieonderhoudskooi. Verder, in plaats van te vertrouwen op een gradiënt, maakt het protocol gebruik van twee relatief grote secties van consistente interne temperatuur, waardoor natuurlijke zwerven van de insecten op hun voorkeurstemperatuur en een eenvoudige binaire score mogelijk is. Vandaar dat het hier beschreven apparaat en protocol een goedkope en eenvoudige manier bieden om de voorkeur voor de temperatuur van muggen te bestuderen in een minder belemmerende en meer realistische omgeving.
Het protocol omvat de voorbereiding van de insecten vóór het experiment, gevolgd door de opstelling van het apparaat met twee kamers. Verdere stappen omvatten het plaatsen van insecten in het apparaat om de keuze van de temperatuur en het scoren van resultaten mogelijk te maken. Voor een illustratie van de methode hier, kozen we de optimale (standaard kweek)temperatuur van de insecten, 27 °C voor Aedes aegypti, 25 °C voor Drosophila melanogaster, en een hogere afweertemperatuur voor beide soorten insecten, respectievelijk 30 °C en 28 °C. Insecten krijgen 30 minuten om een voorkeurskamer te selecteren. Deze tijd bleek voldoende te zijn en een langere duur veranderde niets aan de resultaten; dit kan echter worden uitgebreid afhankelijk van soort /temperatuur / andere variabelen indien nodig.
Protocol
Representative Results
Discussion
De studie beschrijft een nieuwe methode om de temperatuurvoorkeur bij muggen te observeren. Bij deze methode worden muggen vrijgelaten in een buis die is verbonden met twee incubators met onafhankelijk regelbare temperaturen. Op deze manier kunnen de muggen vrij kiezen tussen twee temperaturen zonder hun natuurlijke gedrag en mechanisme van het uitdrukken van deze keuze (bijvoorbeeld vliegen) te verstoren.
Ons eerste representatieve experiment gebruikte de mug optimale temperatuur van 27 °C in beide kamers. Tijdens de herhalingen van dit experiment werden muggen waargenomen die gedurende de hele 30 minuten vrij tussen beide kooien vlogen, en in alle replicaties waren er bijna gelijke aantallen in elk van de twee kamers. Dit bevestigde de experimentele intentie om de muggen de mogelijkheid te geven om vrij te kiezen tussen kooien terwijl ze hun natuurlijke gedrag vertonen (vliegen). Omgekeerd gebruikte het tweede representatieve experiment de aantrekkelijke optimale temperatuur van 27 °C in één kamer en een suboptimale en dus afstotende temperatuur van 30 °C in de tweede kamer. Zoals verwacht, selecteerden muggen consequent de optimale temperatuurkamer met hoge betekenis, zelfs toen we de incubators verwisselden om vertekening te voorkomen.
We hebben de opstelling ook getest op een ander insect, D. melanogaster (fruitvliegen), dat een ander ectotherm modelorganisme vertegenwoordigt. Eén kamer werd ingesteld op de optimale temperatuur van D. melanogaster, 25 °C, en de andere was ingesteld op 3 °C hoger, 28 °C. Net als muggen gaven fruitvliegen ook de voorkeur aan hun optimale temperatuur en vermeden ze de warmere kamer. Dit toont aan dat het protocol geschikt is voor een reeks ectothermen.
Beschrijving van kritieke stappen in het protocol
De belangrijkste kritieke stap in het protocol is de behandeling van insecten, omdat het de mogelijkheid genereert dat insecten ontsnappen. Dit kan worden voorkomen door vast te stellen dat er geen gaten zijn die groot genoeg zijn om te ontsnappen in de gebruikte kooien, dat de elastiekjes / kabelbinders die worden gebruikt om de gaashulzen aan de brug te bevestigen strak zijn en dat de afdekking voor het inbrenggat van het insect op de brug stevig is bevestigd en afgedicht.
Het is ook cruciaal om ervoor te zorgen dat insecten niet ontsnappen voor of na het experiment, vooral wanneer de insecten nodig zijn voor stroomafwaartse experimenten of latere tijdstippen voor verschillende temperatuurkeuzes. Dit kan worden gedaan door de insecten te verdoven voordat ze in de acrylbrug worden geplaatst (met ijs voor Drosophila en CO2 voor muggen) en CO2 in de brug vrij te geven om de insecten na de experimenten neer te halen, voorafgaand aan het berekenen. Het gebruik van CO2 is ideaal voor muggen omdat het de gedragsresultaten niet beïnvloedt21. Bij vliegen kan blootstelling aan CO2 hun vlieggedrag veranderen23, daarom wordt het aanbevolen om ijs22 te gebruiken.
Het tellen van insecten is ook een cruciale stap, om ervoor te zorgen dat het aantal insecten gelijk is voor en na het experiment voor nauwkeurige resultaten. Om dit te doen, raden we het gebruik van een CO2-pen aan zodra het experiment is voltooid om de insecten die zich in de brug bevinden neer te halen. Dit zal helpen de insecten naar beide zijden van de kamer te verplaatsen, waardoor het aantal ontsnapten wordt verminderd. We benadrukken ook in het protocol dat insecten tijdens het scheiden van de kooien in de mouwen van de kooien kunnen worden gevangen; zorg er daarom voor dat deze grondig worden gecontroleerd tijdens het tellen.
Mogelijke wijzigingen en probleemoplossing van de techniek
De grootste moeilijkheid met deze techniek is het flexibele gaas van de kooihulzen, wat resulteert in openingen of schuilplaatsen en dus insecten ontsnappen of vangen. Er zijn enkele mogelijke aanpassingen, indien nodig, om de techniek te verbeteren. We raden aan om twee of meer elastiekjes te gebruiken om ervoor te zorgen dat de brug goed tussen de kamers is bevestigd zonder potentiële ruimte voor de insecten achter te laten (los gaas creëert een schuilplaats voor insecten). We adviseren ook om bij het monteren van het apparaat bijzondere zorg te besteden aan het strak trekken van de mesh sleevet, zoals beschreven in stap 2.6.
Incubators met een kleine vormfactor worden meestal alleen verwarmd (d.w.z. hebben geen actieve koeling), zoals het geval was voor de incubators die hier worden gebruikt. Bijgevolg zal het gebruik van temperaturen rond of onder de omgevingstemperatuur vereisen dat het experiment in een koude ruimte wordt uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de voor de incubators ingestelde temperaturen zo laag als gewenst worden.
Daarnaast kan deze opstelling ook worden gebruikt voor BSL 3, waar een klasse drie bioveiligheidskast (handschoenenkastje) nodig is. In dit geval moet het handschoenenkastje groot genoeg zijn om het hele apparaat te passen. Het experiment dat in dit protocol wordt beschreven, is ideaal voor experimenten in een handschoenenkastje omdat alles wat nodig is in het dashboardkastje wordt opgenomen en, belangrijker nog, de kans dat insecten ontsnappen minimaal is.
Ten slotte is er voldoende ruimte in de incubators om extern licht of een vochtigheidsbron toe te voegen zonder de insecten in de kooien te beïnvloeden. Afhankelijk van de insectensoort of het experimentele ontwerp, kan een LED-lamp met een dikte van 1 cm eenvoudig bovenop de kooi in een of beide incubators worden geplaatst. Het leveren van licht aan beide en het aanbieden van een temperatuurkeuze kan een realistischer protocol zijn voor sommige lichtgevoelige experimentele ontwerpen, of alleen het leveren van licht (of vochtigheid) aan één kamer is een mogelijke wijziging van het protocol om de keuze voor licht / vochtigheid te beoordelen.
Voordelen van deze techniek in het kader van dual choice temperatuurvoorkeurtesten
De hier beschreven methode biedt een alternatief voor de traditionele temperatuurgradiëntmethode die in eerdere studies is beschreven 10,13,14,16. In de meeste van deze studies wordt een groot horizontaal aluminium blok met een thermische gradiënt gebruikt, terwijl het mechanisme van het genereren van deze gradiënt varieert, inclusief verwarmings- / koelblokken, waterbaden, enz. In deze gevallen wordt de temperatuurgradiënt geproduceerd op het oppervlak van het aluminiumblok (in plaats van de luchttemperatuur in een kooi). Bijgevolg beperken de meeste (maar niet alle) alternatieve technieken het vliegvermogen van insecten meer dan dit protocol. Hier kunnen insecten relatief vrij tussen kooien vliegen, waardoor een meer realistische uitdrukking van natuurlijk gedrag in keuze mogelijk is. Het zou zelfs mogelijk zijn om dit experimentele apparaat op te schalen met behulp van grotere kooien en incubators, bijvoorbeeld voor grotere insecten.
Naast het voordeel van natuurlijk gedrag, demonstreren we ook een zeer hoge temperatuuruniformiteit binnen de twee kamers, waardoor eenvoudige scores en een duidelijke selectie van twee grote enkele temperatuurkamers mogelijk zijn. Het gebruik van een binair ontwerp met grote kamers zoals dit kan ruis in de gegevens verminderen, waarbij, bijvoorbeeld op een gradiëntapparaat, elke incidentele beweging van de insecten de positie op de gradiënt en dus hun waargenomen temperatuurvoorkeur zal veranderen.
De hier beschreven techniek is ook heel eenvoudig en goedkoop. Deze techniek heeft geen extra apparaten nodig om de temperaturen in te stellen (d.w.z. een waterbad10 en /of een kookplaat 11,12,13,14,15), geen gespecialiseerde apparatuur naast een gesneden acrylbuis en geboorde gaten, en geen camera18,19 of geavanceerde software19 voor analyse. Dergelijke componenten die in andere technieken worden gebruikt, kunnen duur zijn en / of aanzienlijke expertise en testen vereisen om experimenten te starten.
Deze techniek kan ook worden gerepliceerd met verschillende apparaten die batterijen gebruiken als er geen externe voeding is, waardoor het systeem ideaal is om experimenten in het veld uit te voeren. Bovendien kan hetzelfde apparaat enigszins worden aangepast om andere binaire keuzevoorkeursituaties te bestuderen, zoals licht versus donker, hoge / lage luchtvochtigheid, enz., Hetzij in het laboratorium of in het veld.
Het full-size apparaat in het protocol is aanzienlijk kleiner dan temperatuurgradiëntopstellingen, waardoor het gemakkelijker past in een BSL 3-dashboardkastje zoals hierboven beschreven. Verder zijn de insecten gemakkelijker te bevatten, omdat ze aan het einde van het experiment met CO2 kunnen worden neergehaald en de kooien snel opnieuw kunnen worden afgesloten na scheiding van de brug. Deze containmentvoordelen zijn ideaal voor BSL 3-werk.
We erkennen echter dat ons apparaat alleen een binaire beslissing mogelijk maakt in plaats van een vrije keuze langs een gradiënt, die, afhankelijk van de toepassing, extra runs kan vereisen om optimale temperaturen te identificeren.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AHR erkent de financiële steun van Majlis Amanah Rakyat (MARA).
Materials
| Acrylic tube (Bridge) | Perspex | 900 mm OD | Size (Length x diameter): 8 cm x 9 cm; 1 cm bigger than the size of the hole in front of the incubator. Size of the hole on top: 1.6 cm |
| Carbon dioxide (CO2) inflator | Peaken | B08HM2BDDB | Any CO2 pen will work |
| Digital Incubator (×2) | VWR | VWR INCU-Line 1L 10 (390-0384) | Size of hole in front of incubator: 8 cm diameter. Holes need to be position in the center and have the same exact position on both incubators to allow alignment of bridge.This should be pre-drilled using a standard 8 cm ‘holesaw’ drill bit. Incubator must be just large enough to contain one mosquito cage. |
| Mechanical aspirator (for mosquitoes) | Watkins and Doncaster | E710 | Ideal barrel size 50 x 28 mm and tube diameter 9mm. |
| Mosquito cage (×3; two for the experiments, one for storing insects) | BugDorm | BD4S1515 | Size: 17.5 cm x 17.5 cm x 17.5 cm with 12 cm sleeve opening. Mesh material : Knitted nylon |
| Plastic funnel | Diameter of opening = 5 cm Length of funnel = 5 cm Diameter of aperture = 1 cm |
||
| Plastic Pocket Pooter (for Drosophila or small insects) | Watkins and Doncaster | E714 | Manual/mouth aspirated |
| Rubber band or Reusable cable tie | Either, depending on preference. | ||
| Temperature probe | Eidyer | B07J4T1VQZ | Any thermometer with at least 100 cm narrow wire probe |
References
- Wright, R. K., Cooper, E. L. Temperature effects on ectotherm immune responses. Developmental & Comparative Immunology. 5, 117-122 (1981).
- Deal, J. The temperature preferendum of certain insects. The Journal of Animal Ecology. 10 (2), 323-356 (1941).
- Hongoh, V., Berrang-Ford, L., Scott, M. E., Lindsay, L. R. Expanding geographical distribution of the mosquito, Culex pipiens, in Canada under climate change. Applied Geography. 33, 53-62 (2012).
- Beck-Johnson, L. M., et al. The importance of temperature fluctuations in understanding mosquito population dynamics and malaria risk. Royal Society Open Science. 4 (3), 160969 (2017).
- Erraguntla, M., et al. Predictive model for microclimatic temperature and its use in mosquito population modeling. Scientific Reports. 11 (1), 18909 (2021).
- Shapiro, L. L., Whitehead, S. A., Thomas, M. B. Quantifying the effects of temperature on mosquito and parasite traits that determine the transmission potential of human malaria. PLoS Biology. 15 (10), 20033489 (2017).
- Zhang, Y., et al. Decline in symbiont-dependent host detoxification metabolism contributes to increased insecticide susceptibility of insects under high temperature. The ISME Journal. 15 (12), 3693-3703 (2021).
- Amarasekare, P., Savage, V. A framework for elucidating the temperature dependence of fitness. The American Naturalist. 179 (2), 178-191 (2012).
- Buckley, L. B., Nufio, C. R. Elevational clines in the temperature dependence of insect performance and implications for ecological responses to climate change. Conservation Physiology. 2 (1), 035 (2014).
- MacLean, H. J., et al. Temperature preference across life stages and acclimation temperatures investigated in four species of Drosophila. Journal of Thermal Biology. 86, 102428 (2019).
- Castañeda, L. E., Romero-Soriano, V., Mesas, A., Roff, D. A., Santos, M. Evolutionary potential of thermal preference and heat tolerance in Drosophila subobscura. Journal of Evolutionary Biology. 32 (8), 818-824 (2019).
- Weldon, C. W., Terblanche, J. S., Bosua, H., Malod, K., Chown, S. L. Male Mediterranean fruit flies prefer warmer temperatures that improve sexual performance. Journal of Thermal Biology. 108, 103298 (2022).
- Sayeed, O., Benzer, S. Behavioral genetics of thermosensation and hygrosensation in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93 (12), 6079-6084 (1996).
- Verhulst, N. O., Brendle, A., Blanckenhorn, W. U., Mathis, A. Thermal preferences of subtropical Aedes aegypti and temperate Ae. japonicus mosquitoes. Journal of Thermal Biology. 91, 102637 (2020).
- Ziegler, R., Blanckenhorn, W. U., Mathis, A., Verhulst, N. O. Video analysis of the locomotory behaviour of Aedes aegypti and Ae. japonicus mosquitoes under different temperature regimes in a laboratory setting. Journal of Thermal Biology. 105, 103205 (2022).
- Blanford, S., Read, A. F., Thomas, M. B. Thermal behaviour of Anopheles stephensi in response to infection with malaria and fungal entomopathogens. Malaria Journal. 8, 72 (2009).
- Nakae, T. Temperature-related anomalies in the growth of selected bacteria. Journal of Dairy Science. 54 (12), 1780-1783 (1971).
- Rajpurohit, S., Schmidt, S. P. Measuring thermal behavior in smaller insects: A case study in Drosophila melanogaster demonstrates effects of sex, geographic origin, and rearing temperature on adult behavior. Fly. 10 (4), 149-161 (2016).
- Truitt, A. M., Kapun, M., Kaur, R., Miller, W. J. Wolbachia modifies thermal preference in Drosophila melanogaster. Environmental Microbiology. 21 (9), 3259-3268 (2019).
- Reinhold, J. M., et al. Species-specificity in thermopreference and CO2-gated heat-seeking in Culex mosquitoes. Insects. 13 (1), 92 (2022).
- Lin, C. S., Georghiou, G. P. Tolerance of mosquito larvae and pupae to carbon dioxide anesthesia. Mosquito News. 36 (4), 460-461 (1976).
- Ito, F., Awasaki, T. Comparative analysis of temperature preference behavior and effects of temperature on daily behavior in 11 Drosophila species. Scientific Reports. 12 (1), 1-15 (2022).
- Bartholomew, N., Burdett, J., VandenBrooks, J., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Scientific Reports. 5, 15298 (2015).
