Определение температурных предпочтений комаров и других эктотерм
Summary
Насекомые имеют оптимальный диапазон температур окружающей среды, в котором они стремятся оставаться, и многие внешние и внутренние факторы могут изменить это предпочтение. Здесь мы описываем экономически эффективный и простой метод изучения выбора температуры, который позволяет насекомым свободно демонстрировать свое естественное поведение.
Abstract
Большинство насекомых и других эктотерм имеют относительно узкое оптимальное температурное окно, и отклонение от их оптима может оказать существенное влияние на их приспособленность, а также другие характеристики. Следовательно, многие такие эктотермы ищут свой оптимальный температурный диапазон. Хотя температурные предпочтения комаров и других насекомых были хорошо изучены, традиционная экспериментальная установка выполняется с использованием градиента температуры на алюминиевой поверхности в сильно закрытом пространстве. В некоторых случаях это оборудование ограничивает многие естественные виды поведения, такие как полет, что может быть важно при выборе предпочтений.
Целью данного исследования является наблюдение за предпочтениями насекомых температуре воздуха с помощью двухкамерного аппарата с достаточным пространством для полета. Две камеры состоят из независимых инкубаторов с контролируемой температурой, каждый из которых имеет большое отверстие. Инкубаторы соединены этими отверстиями с помощью короткого акрилового моста. Внутри инкубаторов находятся две сетчатые клетки, связанные через отверстия и мост, что позволяет насекомым свободно летать между различными условиями. Акриловый мост также действует как градиент температуры между двумя инкубаторами.
Благодаря просторной площади в клетке и легкой конструкции, этот метод может быть использован для изучения любой небольшой эктотермы и / или любой манипуляции, которая может изменить температурные предпочтения, включая манипуляции с органами чувств, диету, кишечную флору и присутствие эндосимбионта на уровнях биобезопасности 1 или 2 (BSL 1 или 2). Кроме того, аппарат может быть использован для исследования патогенной инфекции с использованием дополнительной локализации (например, внутри шкафа биобезопасности) в BSL 3.
Introduction
Организмы могут жить и размножаться только в пределах своего диапазона тепловой толерантности. Поскольку температура окружающей среды меняется из-за смены сезонов и глобального потепления, виды должны адаптироваться и реагировать соответствующим образом, чтобы обеспечить свое выживание. Сюда относятся эктотермы, где температура тела находится в равновесии с окружающей средой1. Следовательно, каждое насекомое имеет свой собственный оптимальный температурный диапазон окружающей среды, который они стремятся оставаться в пределах2.
Температура является одним из важных факторов, используемых для прогнозирования распределения и ареала насекомых 3,4,5, наблюдения за взаимоотношениями патоген-насеком 6,7 и влиянием внешних факторов на приспособленность эктотерм, таких как их взрослая продолжительность жизни, плодовитость и скорость питания 8,9.
Предыдущие исследования исследовали предпочтительную температуру эктотерм с различными установками. Наиболее распространенным является использование большого алюминиевого блока с охлаждаемой или нагретой водяной баней10, ледяной ванны и программируемым нагревательным элементом11, холодной и конфоркой 12,13, пластинами терморегулятора 14,15 или тепловым пакетом и пакетом со льдом16 на обоих концах для создания градиента температуры. Кроме того, в других исследованиях также использовался инкубатор градиента температуры для изучения роста выбранных бактерий17 и установлен алюминиевый стержень на термоэлектрическом устройстве (нагретом и охлажденном на концах) для наблюдения теплового предпочтения Drosophila melanogaster18,19.
Однако альтернативная методология, предложенная здесь, имеет значительные преимущества для некоторых применений насекомых. Во-первых, другие решения требуют полного строительства с нуля из основных материалов, включая алюминиевые листы, строительство акриловых камер для насекомых и часто настройку камеры и специальное программное обеспечение; это может быть дорогостоящим и трудоемким для настройки. Во-вторых, многие альтернативные аппараты полагаются на градиент температуры на поверхности (в отличие от температуры воздуха). Следовательно, камера, в которой изучаются насекомые, часто очень узкая (например, градиенты длиной 24 см с шириной всего 2 см и глубиной 1см 16), что может препятствовать естественному поведению, такому как полет, которые необходимы для нормальной мобильности насекомых и, следовательно, необходимы при выборе предпочтительной температуры. Некоторые исследования действительно измеряют температуру воздуха; тем не менее, оценка выбора по-прежнему включает в себя подсчет количества комаров, приземляющихся на элементы Пельтье, в отличие от насекомых, свободно летающих в клетках20.
В этом исследовании мы описываем более простую установку, которая использует минимально модифицированное стандартное оборудование и предоставляет насекомым достаточно места для полета и относительно беспрепятственной навигации в клетке для содержания колоний стандартного размера. Кроме того, вместо того, чтобы полагаться на градиент, протокол использует два относительно больших участка с постоянной внутренней температурой, что позволяет естественным образом перемещать насекомых при их предпочтительной температуре и простую двоичную оценку. Следовательно, устройство и протокол, описанные здесь, обеспечивают недорогое и простое средство изучения температурных предпочтений комаров в менее обструктивной и более реалистичной обстановке.
Протокол включает в себя подготовку насекомых перед экспериментом с последующей установкой двухкамерного аппарата. Дальнейшие шаги включают размещение насекомых в аппарате, чтобы обеспечить выбор температуры и оценку результатов. Для иллюстрации метода здесь мы выбрали оптимальную (стандартную для выращивания) температуру насекомых, 27 ° C для Aedes aegypti, 25 ° C для Drosophila melanogaster и более высокую температуру отпугивания для обоих видов насекомых, 30 ° C и 28 ° C соответственно. Насекомым дается 30 мин, чтобы выбрать предпочтительную камеру. Этого времени было признано достаточным, и более длительная продолжительность не изменила результатов; однако это может быть расширено в зависимости от вида/температуры/других переменных по мере необходимости.
Protocol
Representative Results
Discussion
В исследовании описан новый метод наблюдения температурных предпочтений у комаров. При этом способе комаров выпускают в трубку, которая соединена с двумя инкубаторами с независимо контролируемыми температурами. Таким образом, комарам разрешается свободно выбирать между двумя температурами, не нарушая их естественное поведение и механизм выражения этого выбора (например, полет).
В нашем первом репрезентативном эксперименте использовалась оптимальная температура комаров 27 °C в обеих камерах. Во время повторений этого эксперимента было замечено, что комары свободно летают между обеими клетками в течение всех 30 минут, и во всех репликах в каждой из двух камер было почти равное количество. Это подтвердило экспериментальное намерение позволить комарам свободно выбирать между клетками, демонстрируя при этом свое естественное поведение (полет). И наоборот, во втором репрезентативном эксперименте использовалась привлекательная оптимальная температура 27 °C в одной камере и неоптимальная и, следовательно, отталкивающая температура 30 °C во второй камере. Как и ожидалось, комары последовательно выбирали оптимальную температурную камеру при высокой значимости, даже когда мы меняли инкубаторы, чтобы избежать смещения.
Мы также протестировали установку для другого насекомого, D. melanogaster (плодовых мух), представляющего собой другой модельный организм эктотермы. Одна камера была установлена на оптимальную температуру D. melanogaster, 25 °C, а другая была установлена на 3 °C выше, 28 °C. Подобно комарам, плодовые мухи также предпочитали свою оптимальную температуру и избегали более теплой камеры. Это демонстрирует, что протокол подходит для целого ряда эктотерм.
Описание критических шагов в протоколе
Основным критическим шагом в протоколе является обращение с насекомыми, поскольку оно создает возможность побега насекомых. Это можно предотвратить, определив, что в используемых клетках нет отверстий, достаточно больших для побега, что резиновые ленты / кабельные стяжки, используемые для крепления сетчатых втулок к мосту, являются плотными и что крышка для отверстия для вставки насекомых на мосту надежно прикреплена и герметизирована.
Также крайне важно обеспечить, чтобы насекомые не убегали до или после эксперимента, особенно когда насекомые необходимы для экспериментов вниз по течению или более поздних временных точек для различных вариантов температуры. Это можно сделать, обезболивая насекомых перед помещением их в акриловый мост (используя лед для дрозофилы и CO2 для комаров) и выпуская CO2 в мост, чтобы сбить насекомых после экспериментов, до расчета. Использование CO2 идеально подходит для комаров, поскольку оно не повлияет на поведенческие результаты21. У мух воздействие CO2 может изменить их летное поведение23, поэтому рекомендуется использовать лед22.
Подсчет насекомых также является критическим шагом, чтобы убедиться, что количество насекомых одинаково до и после эксперимента для получения точных результатов. Для этого мы рекомендуем использовать ручку CO2 после завершения эксперимента, чтобы сбить насекомых, которые находятся в мосту. Это поможет переместить насекомых по обе стороны камеры, тем самым уменьшая количество беглецов. Мы также подчеркиваем в протоколе, что насекомые могут быть пойманы в рукава клеток во время разделения клеток; поэтому убедитесь, что они тщательно проверены во время подсчета.
Возможные модификации и устранение неисправностей техники
Основная трудность с этой техникой заключается в гибкой сетке рукавов клетки, что приводит к разрывам или укрытиям и, следовательно, к побегу насекомых или ловушке. Есть некоторые потенциальные модификации, если это необходимо, для улучшения техники. Мы предлагаем использовать две или более резинки, чтобы обеспечить правильное закрепление моста между камерами, не оставляя потенциального пространства для насекомых (свободная сетка создает укрытие для насекомых). Мы также советуем с особой осторожностью натягивать сетчатую втулку, как описано в шаге 2.6, при сборке аппарата.
Инкубаторы малого форм-фактора обычно только нагреваются (т.е. не имеют активного охлаждения), как это было в случае с инкубаторами, используемыми здесь. Следовательно, использование температур вокруг или ниже температуры окружающей среды в помещении потребует проведения эксперимента в холодной камере, чтобы гарантировать, что температуры, установленные для инкубаторов, будут настолько низкими, насколько это необходимо.
Кроме того, эта установка также может быть использована для BSL 3, где необходим шкаф биобезопасности третьего класса (бардачок). В этом случае бардачок должен быть достаточно большим, чтобы вместить весь аппарат. Эксперимент, описанный в этом протоколе, идеально подходит для экспериментов в бардачке, потому что все необходимое будет содержаться в перчаточном ящике и, что важно, возможность побега насекомых минимальна.
Наконец, в инкубаторах достаточно места, чтобы добавить внешний свет или источник влажности, не влияя на насекомых в клетках. В зависимости от вида насекомых или экспериментальной конструкции светодиодная лампа толщиной 1 см может быть легко размещена поверх клетки внутри одного или обоих инкубаторов. Предоставление света обоим и выбор температуры может быть более реалистичным протоколом для некоторых фоточувствительных экспериментальных конструкций, или только обеспечение света (или влажности) в одной камере является возможной модификацией протокола для оценки выбора света / влажности.
Преимущества данного метода в контексте анализа температурных предпочтений с двойным выбором
Метод, описанный здесь, представляет собой альтернативу традиционному методу градиента температуры, описанному в предыдущих исследованиях 10,13,14,16. В большинстве этих исследований используется большой горизонтальный алюминиевый блок с тепловым градиентом, при этом механизм генерации этого градиента варьируется, включая нагревательные/охлаждающие блоки, водяные бани и т.д. В этих случаях градиент температуры создается на поверхности алюминиевого блока (а не температура воздуха в клетке). Следовательно, большинство (но не все) альтернативные методы ограничивают способность насекомых к полету больше, чем этот протокол. Здесь насекомые могут относительно свободно летать между клетками, что позволяет более реалистично выражать естественное поведение в выборе. Можно было бы даже масштабировать этот экспериментальный аппарат, используя большие клетки и инкубаторы, например, для более крупных насекомых.
В дополнение к естественному преимуществу поведения, мы также демонстрируем очень высокую однородность температуры в двух камерах, что позволяет легко оценивать и четко выбирать две большие одиночные температурные камеры. Использование двоичной конструкции большой камеры, такой как эта, может уменьшить шум в данных, где, например, на градиентном устройстве, любое случайное движение насекомых изменит положение на градиенте и, следовательно, их воспринимаемые температурные предпочтения.
Техника, описанная здесь, также очень проста и недорога. Этот метод не нуждается в дополнительных приборах для установки температуры (например, водяная баня10 и / или конфорка 11,12,13,14,15), никакого специального оборудования, кроме разрезанной акриловой трубки и просверленных отверстий, и никакой камеры18,19 или сложного программного обеспечения19 для анализа. Такие компоненты, используемые в других методах, могут быть дорогостоящими и/или требовать значительных знаний и испытаний для начала экспериментов.
Этот метод также может быть воспроизведен с различными устройствами, которые используют батареи, если нет внешнего источника питания, что делает систему идеальной для проведения экспериментов в полевых условиях. Кроме того, тот же аппарат может быть слегка модифицирован для изучения других ситуаций предпочтения бинарного выбора, таких как свет против темноты, высокая / низкая влажность и т. Д., Либо в лаборатории, либо в полевых условиях.
Полноразмерное устройство в протоколе значительно меньше, чем настройки градиента температуры, что позволяет легче помещаться внутрь перчаточного ящика BSL 3, как описано выше. Кроме того, насекомых легче содержать, так как они могут быть сбиты с ног CO2 в конце эксперимента, а клетки могут быть быстро запечатаны после отделения от моста. Эти преимущества защитной оболочки идеально подходят для работы BSL 3.
Однако мы признаем, что наш аппарат допускает только двоичное решение, а не свободный выбор вдоль градиента, что, в зависимости от приложения, может потребовать дополнительных запусков для определения оптимальных температур.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AHR признает финансовую поддержку со стороны Меджлиса Амана Ракьят (MARA).
Materials
| Acrylic tube (Bridge) | Perspex | 900 mm OD | Size (Length x diameter): 8 cm x 9 cm; 1 cm bigger than the size of the hole in front of the incubator. Size of the hole on top: 1.6 cm |
| Carbon dioxide (CO2) inflator | Peaken | B08HM2BDDB | Any CO2 pen will work |
| Digital Incubator (×2) | VWR | VWR INCU-Line 1L 10 (390-0384) | Size of hole in front of incubator: 8 cm diameter. Holes need to be position in the center and have the same exact position on both incubators to allow alignment of bridge.This should be pre-drilled using a standard 8 cm ‘holesaw’ drill bit. Incubator must be just large enough to contain one mosquito cage. |
| Mechanical aspirator (for mosquitoes) | Watkins and Doncaster | E710 | Ideal barrel size 50 x 28 mm and tube diameter 9mm. |
| Mosquito cage (×3; two for the experiments, one for storing insects) | BugDorm | BD4S1515 | Size: 17.5 cm x 17.5 cm x 17.5 cm with 12 cm sleeve opening. Mesh material : Knitted nylon |
| Plastic funnel | Diameter of opening = 5 cm Length of funnel = 5 cm Diameter of aperture = 1 cm |
||
| Plastic Pocket Pooter (for Drosophila or small insects) | Watkins and Doncaster | E714 | Manual/mouth aspirated |
| Rubber band or Reusable cable tie | Either, depending on preference. | ||
| Temperature probe | Eidyer | B07J4T1VQZ | Any thermometer with at least 100 cm narrow wire probe |
References
- Wright, R. K., Cooper, E. L. Temperature effects on ectotherm immune responses. Developmental & Comparative Immunology. 5, 117-122 (1981).
- Deal, J. The temperature preferendum of certain insects. The Journal of Animal Ecology. 10 (2), 323-356 (1941).
- Hongoh, V., Berrang-Ford, L., Scott, M. E., Lindsay, L. R. Expanding geographical distribution of the mosquito, Culex pipiens, in Canada under climate change. Applied Geography. 33, 53-62 (2012).
- Beck-Johnson, L. M., et al. The importance of temperature fluctuations in understanding mosquito population dynamics and malaria risk. Royal Society Open Science. 4 (3), 160969 (2017).
- Erraguntla, M., et al. Predictive model for microclimatic temperature and its use in mosquito population modeling. Scientific Reports. 11 (1), 18909 (2021).
- Shapiro, L. L., Whitehead, S. A., Thomas, M. B. Quantifying the effects of temperature on mosquito and parasite traits that determine the transmission potential of human malaria. PLoS Biology. 15 (10), 20033489 (2017).
- Zhang, Y., et al. Decline in symbiont-dependent host detoxification metabolism contributes to increased insecticide susceptibility of insects under high temperature. The ISME Journal. 15 (12), 3693-3703 (2021).
- Amarasekare, P., Savage, V. A framework for elucidating the temperature dependence of fitness. The American Naturalist. 179 (2), 178-191 (2012).
- Buckley, L. B., Nufio, C. R. Elevational clines in the temperature dependence of insect performance and implications for ecological responses to climate change. Conservation Physiology. 2 (1), 035 (2014).
- MacLean, H. J., et al. Temperature preference across life stages and acclimation temperatures investigated in four species of Drosophila. Journal of Thermal Biology. 86, 102428 (2019).
- Castañeda, L. E., Romero-Soriano, V., Mesas, A., Roff, D. A., Santos, M. Evolutionary potential of thermal preference and heat tolerance in Drosophila subobscura. Journal of Evolutionary Biology. 32 (8), 818-824 (2019).
- Weldon, C. W., Terblanche, J. S., Bosua, H., Malod, K., Chown, S. L. Male Mediterranean fruit flies prefer warmer temperatures that improve sexual performance. Journal of Thermal Biology. 108, 103298 (2022).
- Sayeed, O., Benzer, S. Behavioral genetics of thermosensation and hygrosensation in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93 (12), 6079-6084 (1996).
- Verhulst, N. O., Brendle, A., Blanckenhorn, W. U., Mathis, A. Thermal preferences of subtropical Aedes aegypti and temperate Ae. japonicus mosquitoes. Journal of Thermal Biology. 91, 102637 (2020).
- Ziegler, R., Blanckenhorn, W. U., Mathis, A., Verhulst, N. O. Video analysis of the locomotory behaviour of Aedes aegypti and Ae. japonicus mosquitoes under different temperature regimes in a laboratory setting. Journal of Thermal Biology. 105, 103205 (2022).
- Blanford, S., Read, A. F., Thomas, M. B. Thermal behaviour of Anopheles stephensi in response to infection with malaria and fungal entomopathogens. Malaria Journal. 8, 72 (2009).
- Nakae, T. Temperature-related anomalies in the growth of selected bacteria. Journal of Dairy Science. 54 (12), 1780-1783 (1971).
- Rajpurohit, S., Schmidt, S. P. Measuring thermal behavior in smaller insects: A case study in Drosophila melanogaster demonstrates effects of sex, geographic origin, and rearing temperature on adult behavior. Fly. 10 (4), 149-161 (2016).
- Truitt, A. M., Kapun, M., Kaur, R., Miller, W. J. Wolbachia modifies thermal preference in Drosophila melanogaster. Environmental Microbiology. 21 (9), 3259-3268 (2019).
- Reinhold, J. M., et al. Species-specificity in thermopreference and CO2-gated heat-seeking in Culex mosquitoes. Insects. 13 (1), 92 (2022).
- Lin, C. S., Georghiou, G. P. Tolerance of mosquito larvae and pupae to carbon dioxide anesthesia. Mosquito News. 36 (4), 460-461 (1976).
- Ito, F., Awasaki, T. Comparative analysis of temperature preference behavior and effects of temperature on daily behavior in 11 Drosophila species. Scientific Reports. 12 (1), 1-15 (2022).
- Bartholomew, N., Burdett, J., VandenBrooks, J., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Scientific Reports. 5, 15298 (2015).
