Determinazione della preferenza di temperatura di zanzare e altri ectotermi
Summary
Gli insetti hanno un intervallo di temperatura ambientale ottimale in cui cercano di rimanere all’interno e molti fattori esterni e interni possono alterare questa preferenza. Qui, descriviamo un metodo economico e semplice per studiare la scelta della temperatura, che consente agli insetti di esibire liberamente i loro comportamenti naturali.
Abstract
La maggior parte degli insetti e di altri ectotermi ha una finestra di temperatura ottimale relativamente stretta e la deviazione dal loro optima può avere effetti significativi sulla loro forma fisica, così come altre caratteristiche. Di conseguenza, molti di questi ectotermi cercano il loro intervallo di temperatura ottimale. Sebbene le preferenze di temperatura delle zanzare e di altri insetti siano state ben studiate, la tradizionale configurazione sperimentale viene eseguita utilizzando un gradiente di temperatura su una superficie di alluminio in uno spazio altamente chiuso. In alcuni casi, questa attrezzatura limita molti comportamenti naturali, come il volo, che possono essere importanti nella selezione delle preferenze.
L’obiettivo di questo studio è osservare la preferenza degli insetti per la temperatura dell’aria utilizzando un apparato a due camere con spazio sufficiente per il volo. Le due camere sono costituite da incubatori indipendenti a temperatura controllata, ciascuno con una grande apertura. Gli incubatori sono collegati da queste aperture utilizzando un breve ponte acrilico. All’interno delle incubatrici ci sono due gabbie a rete, collegate tramite le aperture e il ponte, che consentono agli insetti di volare liberamente tra le diverse condizioni. Il ponte acrilico funge anche da gradiente di temperatura tra i due incubatori.
Grazie all’ampia area della gabbia e alla facile costruzione, questo metodo può essere utilizzato per studiare qualsiasi piccolo ectoterma e / o qualsiasi manipolazione che possa alterare la preferenza di temperatura, compresa la manipolazione degli organi sensoriali, la dieta, la flora intestinale e la presenza di endosimbionti ai livelli di biosicurezza 1 o 2 (BSL 1 o 2). Inoltre, l’apparecchio può essere utilizzato per lo studio dell’infezione da patogeni utilizzando un ulteriore contenimento (ad esempio, all’interno di un armadio di biosicurezza) a BSL 3.
Introduction
Gli organismi possono vivere e riprodursi solo all’interno del loro intervallo di tolleranza termica. Poiché la temperatura ambientale varia a causa del cambiamento delle stagioni e del riscaldamento globale, le specie devono adattarsi e rispondere di conseguenza per garantire la loro sopravvivenza. Ciò include gli ectotermi, in cui la temperatura corporea è in equilibrio con l’ambiente1. Quindi, ogni insetto ha il proprio intervallo di temperatura ambientale ottimale che cercano di rimanere entro2.
La temperatura è uno dei fattori importanti utilizzati per prevedere la distribuzione e la gamma di insetti 3,4,5, osservando le relazioni patogeno-insetto6,7 e l’effetto di fattori esterni sulla fitness degli ectotermi come la loro durata di vita adulta, la fecondità e il tasso di alimentazione 8,9.
Studi precedenti hanno studiato la temperatura preferita degli ectotermi con diverse configurazioni. Il più comune è l’utilizzo di un grande blocco di alluminio con un bagno d’acqua raffreddato o riscaldato 10, un bagno di ghiaccio e un elemento riscaldante programmabile 11, piastre fredde e calde12,13, piastre di regolazione termica 14,15 o un pacchetto termico e un impacco di ghiaccio 16 alle due estremità per creare un gradiente di temperatura. Inoltre, altri studi hanno anche utilizzato un incubatore a gradiente di temperatura per studiare la crescita di batteri selezionati17 e montato un’asta di alluminio su un dispositivo termoelettrico (riscaldato e raffreddato alle estremità) per osservare la preferenza termica di Drosophila melanogaster18,19.
Tuttavia, la metodologia alternativa qui proposta presenta vantaggi significativi per alcune applicazioni di insetti. In primo luogo, altre soluzioni richiedono una costruzione completa da zero con materiali di base, tra cui fogli di alluminio, costruzione di camere acriliche per gli insetti e spesso una configurazione della fotocamera e un software specializzato; Questo può essere costoso e richiedere molto tempo da configurare. In secondo luogo, molti apparecchi alternativi si basano su un gradiente di temperatura su una superficie (al contrario della temperatura dell’aria). Di conseguenza, la camera in cui vengono studiati gli insetti è spesso molto stretta (ad esempio, pendenze lunghe 24 cm con solo 2 cm di larghezza e 1 cm di profondità16), che possono impedire comportamenti naturali, come il volo, che sono essenziali per la normale mobilità degli insetti e quindi indispensabili nella scelta di una temperatura preferita. Alcuni studi misurano la temperatura dell’aria; tuttavia, il punteggio di scelta comporta ancora il conteggio del numero di zanzare che atterrano sugli elementi Peltier rispetto agli insetti che volano liberamente nelle gabbie20.
In questo studio, descriviamo una configurazione più semplice, che utilizza attrezzature standard minimamente modificate e fornisce agli insetti spazio sufficiente per volare e navigare relativamente senza ostacoli in una gabbia di manutenzione della colonia di dimensioni standard. Inoltre, piuttosto che fare affidamento su un gradiente, il protocollo utilizza due sezioni di dimensioni relativamente grandi di temperatura interna costante, consentendo il roaming naturale degli insetti alla loro temperatura preferita e un semplice punteggio binario. Quindi, l’apparato e il protocollo qui descritti forniscono un mezzo semplice e a basso costo per studiare la preferenza della temperatura delle zanzare in un ambiente meno ostruttivo e più realistico.
Il protocollo prevede la preparazione degli insetti prima dell’esperimento seguita dalla configurazione dell’apparato a due camere. Ulteriori passaggi includono il posizionamento di insetti nell’apparato per consentire la scelta della temperatura e il punteggio dei risultati. Per illustrare il metodo, abbiamo scelto la temperatura ottimale (allevamento standard) degli insetti, 27 °C per Aedes aegypti, 25 °C per Drosophila melanogaster, e una temperatura di repulsione più elevata per entrambe le specie di insetti, rispettivamente 30 °C e 28 °C. Agli insetti vengono dati 30 minuti per selezionare una camera preferita. Questo tempo è stato trovato sufficiente e una durata più lunga non ha cambiato i risultati; tuttavia, questo può essere esteso a seconda della specie / temperatura / altre variabili, se necessario.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo studio descrive un nuovo metodo per osservare la preferenza di temperatura nelle zanzare. In questo metodo, le zanzare vengono rilasciate in un tubo collegato a due incubatori con temperature controllabili in modo indipendente. In questo modo, le zanzare sono autorizzate a scegliere liberamente tra due temperature senza interrompere i loro comportamenti naturali e il meccanismo di esprimere questa scelta (ad esempio, volare).
Il nostro primo esperimento rappresentativo ha utilizzato la temperatura ottimale della zanzara di 27 ° C in entrambe le camere. Durante le ripetizioni di questo esperimento, le zanzare sono state osservate volare liberamente tra le due gabbie per tutti i 30 minuti, e in tutte le repliche, c’erano numeri quasi uguali in ciascuna delle due camere. Ciò ha confermato l’intenzione sperimentale di consentire alle zanzare la possibilità di scegliere liberamente tra le gabbie mentre esibiscono i loro comportamenti naturali (volare). Al contrario, il secondo esperimento rappresentativo ha utilizzato la temperatura ottimale attrattiva di 27 °C in una camera e una temperatura sub-ottimale e quindi respingente di 30 °C nella seconda camera. Come previsto, le zanzare hanno costantemente selezionato la camera di temperatura ottimale ad alto significato, anche quando abbiamo scambiato gli incubatori per evitare pregiudizi.
Abbiamo anche testato la configurazione per un insetto diverso, D. melanogaster (moscerini della frutta), che rappresenta un altro organismo modello di ectoterma. Una camera è stata impostata alla temperatura ottimale di D. melanogaster, 25 °C, e l’altra è stata impostata a 3 °C più alta, 28 °C. Simile alle zanzare, anche i moscerini della frutta hanno favorito la loro temperatura ottimale ed evitato la camera più calda. Ciò dimostra che il protocollo è adatto per una serie di ectotermi.
Descrizione dei passaggi critici nel protocollo
Il principale passo critico del protocollo è la gestione degli insetti, in quanto genera la possibilità di fuga degli insetti. Ciò può essere evitato determinando che non ci sono fori abbastanza grandi per la fuga nelle gabbie utilizzate, che gli elastici / fascette utilizzate per fissare i manicotti di rete al ponte sono stretti e che il coperchio per il foro di inserimento degli insetti sul ponte è fissato e sigillato saldamente.
È anche fondamentale garantire che gli insetti non sfuggano prima o dopo l’esperimento, in particolare quando gli insetti sono necessari per la sperimentazione a valle o punti temporali successivi per varie scelte di temperatura. Questo può essere fatto anestetizzando gli insetti prima di metterli nel ponte acrilico (usando ghiaccio per Drosophila e CO 2 per le zanzare) e rilasciando CO2 nel ponte per abbattere gli insetti dopo gli esperimenti, prima di calcolare. L’uso di CO2 è ideale per le zanzare poiché non influenzerà i risultati comportamentali21. Nei moscerini, l’esposizione alla CO2 può alterare il loro comportamento di volo23, quindi si raccomanda di usare ghiaccio22.
Anche il conteggio degli insetti è un passo critico, per garantire che il numero di insetti sia uguale prima e dopo l’esperimento per risultati accurati. Per fare ciò, raccomandiamo l’uso di una penna CO2 una volta completato l’esperimento per abbattere gli insetti che si trovano nel ponte. Ciò contribuirà a spostare gli insetti su entrambi i lati della camera, riducendo così il numero di fuggitivi. Evidenziamo inoltre nel protocollo che gli insetti possono essere catturati nelle maniche delle gabbie durante la separazione della gabbia; Pertanto, assicurarsi che questi siano controllati accuratamente durante il conteggio.
Potenziali modifiche e risoluzione dei problemi della tecnica
La principale difficoltà con questa tecnica è la rete flessibile delle maniche della gabbia con conseguente lacuna o nascondiglio e quindi fuga o cattura degli insetti. Ci sono alcune potenziali modifiche, se necessario, per migliorare la tecnica. Si consiglia di utilizzare due o più elastici per garantire che il ponte sia fissato correttamente tra le camere senza lasciare spazio potenziale per gli insetti (la rete sciolta crea uno spazio nascosto per gli insetti). Si consiglia inoltre di prestare particolare attenzione a tirare il manicotto a rete teso, come descritto al punto 2.6, durante il montaggio dell’apparecchio.
Gli incubatori con fattore di forma ridotto sono solitamente riscaldati solo (cioè non hanno raffreddamento attivo), come nel caso degli incubatori utilizzati qui. Di conseguenza, l’utilizzo di temperature intorno o inferiori alla temperatura ambiente richiederà che l’esperimento venga eseguito in una cella frigorifera per garantire che le temperature impostate per gli incubatori scendano al minimo desiderato.
Inoltre, questa configurazione può essere utilizzata anche per BSL 3, dove è necessario un armadio di biosicurezza di classe tre (vano portaoggetti). In questo caso, il vano portaoggetti deve essere abbastanza grande da contenere l’intero apparato. L’esperimento descritto in questo protocollo è ideale per gli esperimenti in un vano portaoggetti perché tutto il necessario sarà contenuto all’interno del vano portaoggetti e, soprattutto, la possibilità che gli insetti fuggano è minima.
Infine, c’è abbastanza spazio negli incubatori per aggiungere luce esterna o una fonte di umidità senza influenzare gli insetti nelle gabbie. A seconda della specie di insetto o del design sperimentale, una lampada a LED con uno spessore di 1 cm può essere facilmente posizionata sopra la gabbia all’interno di uno o entrambi gli incubatori. Fornire luce a entrambi e offrire una scelta di temperatura può essere un protocollo più realistico per alcuni progetti sperimentali fotosensibili, o fornire solo luce (o umidità) a una camera è una possibile modifica al protocollo per valutare la scelta di luce / umidità.
Vantaggi di questa tecnica nel contesto dei saggi di preferenza di temperatura a doppia scelta
Il metodo qui descritto presenta un’alternativa al tradizionale metodo del gradiente di temperatura descritto negli studi precedenti10,13,14,16. Nella maggior parte di questi studi, viene utilizzato un grande blocco orizzontale di alluminio con un gradiente termico, mentre il meccanismo di generazione di questo gradiente varia, inclusi blocchi di riscaldamento / raffreddamento, bagni d’acqua, ecc. In questi casi, il gradiente di temperatura viene prodotto sulla superficie del blocco di alluminio (piuttosto che sulla temperatura dell’aria in una gabbia). Di conseguenza, la maggior parte (ma non tutte) le tecniche alternative limitano la capacità di volo degli insetti più di questo protocollo. Qui, gli insetti possono volare relativamente liberamente tra le gabbie, consentendo un’espressione più realistica dei comportamenti naturali nella scelta. Sarebbe anche possibile ampliare questo apparato sperimentale utilizzando gabbie e incubatori più grandi, ad esempio per insetti più grandi.
Oltre al vantaggio del comportamento naturale, dimostriamo anche un’uniformità di temperatura molto elevata all’interno delle due camere, consentendo un punteggio semplice e una chiara selezione di due grandi camere a temperatura singola. L’uso di un design binario a grande camera come questo può ridurre il rumore nei dati, dove, ad esempio su un apparato a gradiente, qualsiasi movimento accidentale degli insetti altererà la posizione sul gradiente e quindi la loro preferenza di temperatura percepita.
La tecnica qui descritta è anche molto semplice e a basso costo. Questa tecnica non ha bisogno di apparecchi aggiuntivi per impostare le temperature (ad esempio, un bagno d’acqua10 e / o una piastra riscaldante 11,12,13,14,15), nessuna attrezzatura specialistica oltre a un tubo acrilico tagliato e fori praticati, e nessuna fotocamera 18,19 o software sofisticato 19 per l’analisi. Tali componenti utilizzati in altre tecniche possono essere costosi e / o richiedere competenze e test significativi per iniziare gli esperimenti.
Questa tecnica può anche essere replicata con diversi dispositivi che utilizzano batterie se non c’è alimentazione esterna, rendendo il sistema ideale per condurre esperimenti sul campo. Inoltre, lo stesso apparato potrebbe essere leggermente modificato per studiare altre situazioni di preferenza di scelta binaria, come luce contro buio, alta / bassa umidità, ecc., Sia in laboratorio che sul campo.
L’apparecchiatura di dimensioni standard nel protocollo è significativamente più piccola delle configurazioni a gradiente di temperatura, consentendo una più facile installazione all’interno di un vano portaoggetti BSL 3 come descritto sopra. Inoltre, gli insetti sono più facili da contenere, in quanto possono essere abbattuti con CO2 alla fine dell’esperimento e le gabbie possono essere rapidamente risigillate dopo la separazione dal ponte. Questi vantaggi di contenimento sono ideali per il lavoro BSL 3.
Riconosciamo tuttavia che il nostro apparecchio consente solo una decisione binaria piuttosto che una libera scelta lungo un gradiente, che, a seconda dell’applicazione, può richiedere corse aggiuntive per identificare le temperature ottimali.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AHR riconosce il sostegno finanziario del Majlis Amanah Rakyat (MARA).
Materials
| Acrylic tube (Bridge) | Perspex | 900 mm OD | Size (Length x diameter): 8 cm x 9 cm; 1 cm bigger than the size of the hole in front of the incubator. Size of the hole on top: 1.6 cm |
| Carbon dioxide (CO2) inflator | Peaken | B08HM2BDDB | Any CO2 pen will work |
| Digital Incubator (×2) | VWR | VWR INCU-Line 1L 10 (390-0384) | Size of hole in front of incubator: 8 cm diameter. Holes need to be position in the center and have the same exact position on both incubators to allow alignment of bridge.This should be pre-drilled using a standard 8 cm ‘holesaw’ drill bit. Incubator must be just large enough to contain one mosquito cage. |
| Mechanical aspirator (for mosquitoes) | Watkins and Doncaster | E710 | Ideal barrel size 50 x 28 mm and tube diameter 9mm. |
| Mosquito cage (×3; two for the experiments, one for storing insects) | BugDorm | BD4S1515 | Size: 17.5 cm x 17.5 cm x 17.5 cm with 12 cm sleeve opening. Mesh material : Knitted nylon |
| Plastic funnel | Diameter of opening = 5 cm Length of funnel = 5 cm Diameter of aperture = 1 cm |
||
| Plastic Pocket Pooter (for Drosophila or small insects) | Watkins and Doncaster | E714 | Manual/mouth aspirated |
| Rubber band or Reusable cable tie | Either, depending on preference. | ||
| Temperature probe | Eidyer | B07J4T1VQZ | Any thermometer with at least 100 cm narrow wire probe |
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