Bestimmung der Temperaturpräferenz von Moskitos und anderen Ektothermen
Summary
Insekten haben einen optimalen Umgebungstemperaturbereich, in dem sie bleiben möchten, und viele externe und interne Faktoren können diese Präferenz ändern. Hier beschreiben wir eine kostengünstige und einfache Methode zur Untersuchung der Temperaturwahl, die es Insekten ermöglicht, ihr natürliches Verhalten frei zu zeigen.
Abstract
Die meisten Insekten und andere Ektothermen haben ein relativ enges optimales Temperaturfenster, und eine Abweichung von ihrem Optima kann erhebliche Auswirkungen auf ihre Fitness sowie andere Eigenschaften haben. Folglich suchen viele solcher Ektothermen ihren optimalen Temperaturbereich. Obwohl die Temperaturpräferenzen von Moskitos und anderen Insekten gut untersucht wurden, wird der traditionelle Versuchsaufbau mit einem Temperaturgradienten auf einer Aluminiumoberfläche in einem stark geschlossenen Raum durchgeführt. In einigen Fällen schränkt diese Ausrüstung viele natürliche Verhaltensweisen ein, wie z. B. das Fliegen, was bei der Auswahl der Präferenzen wichtig sein kann.
Ziel dieser Studie ist es, die Präferenz von Insekten für die Lufttemperatur unter Verwendung einer Zweikammerapparatur mit ausreichend Flugraum zu beobachten. Die beiden Kammern bestehen aus unabhängigen temperaturgesteuerten Inkubatoren mit jeweils großer Apertur. Die Inkubatoren sind durch diese Öffnungen mit einer kurzen Acrylbrücke verbunden. Im Inneren der Inkubatoren befinden sich zwei Netzkäfige, die über die Öffnungen und die Brücke miteinander verbunden sind, so dass die Insekten frei zwischen den verschiedenen Bedingungen fliegen können. Die Acrylbrücke fungiert auch als Temperaturgradient zwischen den beiden Inkubatoren.
Aufgrund des geräumigen Bereichs im Käfig und der einfachen Konstruktion kann diese Methode verwendet werden, um jedes kleine Ektotherm und / oder jede Manipulation zu untersuchen, die die Temperaturpräferenz verändern kann, einschließlich sensorischer Organmanipulation, Ernährung, Darmflora und Endosymbiontenpräsenz auf Biosicherheitsstufe 1 oder 2 (BSL 1 oder 2). Zusätzlich kann das Gerät zur Untersuchung von Erregerinfektionen unter Verwendung eines weiteren Containments (z. B. innerhalb einer Biosicherheitswerkbank) bei BSL 3 verwendet werden.
Introduction
Organismen können nur innerhalb ihres thermischen Toleranzbereichs leben und sich vermehren. Da die Umgebungstemperatur aufgrund von Jahreszeitenänderungen und globaler Erwärmung variiert, müssen sich Arten anpassen und entsprechend reagieren, um ihr Überleben zu sichern. Dazu gehören Ektothermen, bei denen die Körpertemperatur im Gleichgewicht mit der Umgebung ist1. Daher hat jedes Insekt seinen eigenen optimalen Umgebungstemperaturbereich, den sie innerhalbvon 2 halten möchten.
Die Temperatur ist einer der wichtigen Faktoren, die verwendet werden, um die Verteilung und Reichweite von Insekten vorherzusagen 3,4,5, die Beobachtung von Erreger-Insekten-Beziehungen 6,7 und die Wirkung externer Faktoren auf die Fitness von Ektothermen wie ihre Lebensdauer, Fruchtbarkeit und Fressrate 8,9.
Frühere Studien haben die bevorzugte Temperatur von Ektothermen mit unterschiedlichen Aufbauten untersucht. Am gebräuchlichsten ist die Verwendung eines großen Aluminiumblocks entweder mit einem gekühlten oder beheizten Wasserbad 10, einem Eisbad und einem programmierbaren Heizelement 11, kalten und heißen Platten12,13, Wärmereglerplatten 14,15 oder einem Wärmepack und einem Eisbeutel 16 an beiden Enden, um einen Temperaturgradienten zu erzeugen. Darüber hinaus haben andere Studien auch einen Temperaturgradienteninkubator verwendet, um das Wachstum ausgewählter Bakterienzu untersuchen 17 und einen Aluminiumstab auf einer thermoelektrischen Vorrichtung (an den Enden beheizt und gekühlt) montiert, um die thermische Präferenz von Drosophila melanogaster18,19 zu beobachten.
Die hier vorgeschlagene alternative Methodik hat jedoch erhebliche Vorteile für bestimmte Insektenanwendungen. Erstens erfordern andere Lösungen eine komplette Konstruktion von Grund auf mit Grundmaterialien, einschließlich Aluminiumblechen, dem Bau von Acrylkammern für die Insekten und oft einem Kamera-Setup und spezieller Software; Dies kann teuer und zeitaufwendig in der Einrichtung sein. Zweitens beruhen viele alternative Geräte auf einem Temperaturgradienten auf einer Oberfläche (im Gegensatz zur Lufttemperatur). Folglich ist die Kammer, in der die Insekten untersucht werden, oft sehr eng (z. B. 24 cm lange Steigungen mit nur 2 cm Breite und 1 cm Tiefe16), was natürliche Verhaltensweisen wie das Fliegen verhindern kann, die für die normale Mobilität von Insekten unerlässlich sind und daher für die Auswahl einer bevorzugten Temperatur unerlässlich sind. Einige Studien messen die Lufttemperatur; Die Bewertung der Wahl beinhaltet jedoch immer noch die Zählung der Anzahl der Moskitos, die auf den Peltier-Elementen landen, im Gegensatz zu Insekten, die frei in den Käfigen fliegen20.
In dieser Studie beschreiben wir einen einfacheren Aufbau, der minimal modifizierte Standardausrüstung verwendet und Insekten ausreichend Platz bietet, um relativ ungehindert in einem Standard-Pflegekäfig zu fliegen und zu navigieren. Anstatt sich auf einen Gradienten zu verlassen, verwendet das Protokoll zwei relativ große Abschnitte mit konstanter Innentemperatur, die ein natürliches Roaming der Insekten bei ihrer bevorzugten Temperatur und eine einfache binäre Bewertung ermöglichen. Daher bieten die hier beschriebenen Geräte und Protokolle eine kostengünstige und einfache Möglichkeit, die Temperaturpräferenz der Moskitos in einer weniger hinderlichen und realistischeren Umgebung zu untersuchen.
Das Protokoll beinhaltet die Vorbereitung der Insekten vor dem Experiment, gefolgt vom Aufbau der Zweikammerapparatur. Weitere Schritte umfassen das Platzieren von Insekten in der Apparatur, um die Wahl der Temperatur und die Bewertung der Ergebnisse zu ermöglichen. Zur Veranschaulichung der Methode wählten wir hier die optimale (Standardaufzucht-) Temperatur der Insekten, 27 °C für Aedes aegypti, 25 °C für Drosophila melanogaster und eine höhere Abwehrtemperatur für beide Insektenarten, 30 °C bzw. 28 °C. Insekten erhalten 30 Minuten Zeit, um eine bevorzugte Kammer auszuwählen. Diese Zeit erwies sich als ausreichend, und eine längere Dauer änderte nichts an den Ergebnissen; Dies kann jedoch je nach Spezies / Temperatur / anderen Variablen nach Bedarf erweitert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Studie beschreibt eine neue Methode, um die Temperaturpräferenz bei Moskitos zu beobachten. Bei dieser Methode werden Moskitos in eine Röhre freigesetzt, die mit zwei Inkubatoren mit unabhängig steuerbaren Temperaturen verbunden ist. Auf diese Weise können die Moskitos frei zwischen zwei Temperaturen wählen, ohne ihr natürliches Verhalten und ihren Mechanismus zum Ausdruck dieser Wahl (z. B. Fliegen) zu stören.
Unser erstes repräsentatives Experiment verwendete die optimale Mückentemperatur von 27 °C in beiden Kammern. Während der Wiederholung dieses Experiments wurde beobachtet, dass Moskitos während der gesamten 30 Minuten frei zwischen beiden Käfigen flogen, und in allen Replikaten gab es in jeder der beiden Kammern fast die gleiche Anzahl. Dies bestätigte die experimentelle Absicht, den Moskitos die Möglichkeit zu geben, frei zwischen Käfigen zu wählen, während sie ihr natürliches Verhalten (Fliegen) zeigen. Umgekehrt nutzte das zweite repräsentative Experiment die attraktive optimale Temperatur von 27 °C in einer Kammer und eine suboptimale und damit abstoßende Temperatur von 30 °C in der zweiten Kammer. Wie erwartet, wählten Moskitos konsequent die optimale Temperaturkammer mit hoher Signifikanz, auch wenn wir die Inkubatoren austauschten, um Verzerrungen zu vermeiden.
Wir testeten den Aufbau auch für ein anderes Insekt, D. melanogaster (Fruchtfliegen), das einen anderen Ektotherm-Modellorganismus darstellt. Eine Kammer wurde auf die optimale Temperatur von D. melanogaster, 25 °C, und die andere auf 3 °C höher, 28 °C, eingestellt. Ähnlich wie Moskitos begünstigten auch Fruchtfliegen ihre optimale Temperatur und mieden die wärmere Kammer. Dies zeigt, dass das Protokoll für eine Reihe von Ektothermen geeignet ist.
Beschreibung kritischer Schritte im Protokoll
Der wichtigste kritische Schritt im Protokoll ist der Umgang mit Insekten, da es die Möglichkeit der Flucht von Insekten erzeugt. Dies kann verhindert werden, indem festgestellt wird, dass in den verwendeten Käfigen keine Löcher vorhanden sind, die groß genug für eine Flucht sind, dass die Gummibänder / Kabelbinder, die zur Befestigung der Netzhülsen an der Brücke verwendet werden, fest sind und dass die Abdeckung für das Insekteneinführungsloch auf der Brücke sicher befestigt und versiegelt ist.
Es ist auch wichtig, sicherzustellen, dass Insekten nicht vor oder nach dem Experiment entkommen, insbesondere wenn die Insekten für nachgeschaltete Experimente oder spätere Zeitpunkte für verschiedene Temperaturentscheidungen benötigt werden. Dies kann erreicht werden, indem die Insekten vor dem Einsetzen in die Acrylbrücke (mit Eis für Drosophila und CO 2 für Moskitos) und CO2 in die Brücke freigesetzt werden, um die Insekten nach den Experimenten vor der Berechnung niederzuschlagen. Die Verwendung von CO2 ist ideal für Moskitos, da es die Verhaltensergebnisse nicht beeinflusst21. Bei Fliegen kann die Exposition gegenüber CO2 ihr Flugverhaltenverändern 23, daher wird empfohlen, Eis22 zu verwenden.
Das Zählen von Insekten ist ebenfalls ein kritischer Schritt, um sicherzustellen, dass die Anzahl der Insekten vor und nach dem Experiment gleich ist, um genaue Ergebnisse zu erzielen. Um dies zu tun, empfehlen wir nach Abschluss des Experiments die Verwendung eines CO2 -Stifts, um die Insekten, die sich in der Brücke befinden, niederzuschlagen. Dies wird dazu beitragen, die Insekten auf beide Seiten der Kammer zu bewegen, wodurch die Anzahl der Entflohenen reduziert wird. Wir heben im Protokoll auch hervor, dass Insekten während der Käfigtrennung in den Hülsen der Käfige gefangen werden können; Stellen Sie daher sicher, dass diese während der Zählung gründlich überprüft werden.
Mögliche Modifikationen und Fehlerbehebung der Technik
Die Hauptschwierigkeit bei dieser Technik ist das flexible Geflecht der Käfighülsen, das zu Lücken oder Verstecken und damit zu Insektenflucht oder -fallen führt. Es gibt einige mögliche Modifikationen, falls erforderlich, um die Technik zu verbessern. Wir empfehlen, zwei oder mehr Gummibänder zu verwenden, um sicherzustellen, dass die Brücke zwischen den Kammern ordnungsgemäß befestigt ist, ohne dass den Insekten Platz gelassen wird (loses Netz schafft ein Versteck für Insekten). Wir empfehlen auch, bei der Montage des Gerätes besonders darauf zu achten, die Netzhülse straff zu ziehen, wie in Schritt 2.6 beschrieben.
Inkubatoren mit kleinem Formfaktor werden in der Regel nur beheizt (d.h. haben keine aktive Kühlung), wie es bei den hier verwendeten Inkubatoren der Fall war. Folglich erfordert die Verwendung von Temperaturen um oder unter der Umgebungsraumtemperatur, dass das Experiment in einem kalten Raum durchgeführt wird, um sicherzustellen, dass die für die Inkubatoren eingestellten Temperaturen so niedrig wie gewünscht sind.
Darüber hinaus kann dieser Aufbau auch für BSL 3 verwendet werden, wo eine Biosicherheitswerkbank der Klasse drei (Handschuhfach) benötigt wird. In diesem Fall muss das Handschuhfach groß genug sein, um den gesamten Apparat unterzubringen. Das in diesem Protokoll beschriebene Experiment ist ideal für Experimente in einem Handschuhfach, da alles, was benötigt wird, im Handschuhfach enthalten ist und vor allem die Möglichkeit, dass Insekten entkommen, minimal ist.
Schließlich gibt es genug Platz in den Inkubatoren, um externes Licht oder eine Feuchtigkeitsquelle hinzuzufügen, ohne die Insekten in den Käfigen zu beeinträchtigen. Je nach Insektenart oder experimentellem Design kann eine LED-Lampe mit einer Dicke von 1 cm leicht auf dem Käfig in einem oder beiden Inkubatoren platziert werden. Die Bereitstellung von Licht für beide und das Anbieten einer Temperaturwahl kann für einige lichtempfindliche experimentelle Designs ein realistischeres Protokoll sein, oder nur die Bereitstellung von Licht (oder Feuchtigkeit) für eine Kammer ist eine mögliche Änderung des Protokolls zur Beurteilung der Licht- / Feuchtigkeitswahl.
Vorteile dieser Technik im Rahmen von Dual Choice Temperaturpräferenzassays
Die hier beschriebene Methode stellt eine Alternative zu der traditionellen Temperaturgradientenmethode dar, die in früheren Studien10,13,14,16 beschrieben wurde. In den meisten dieser Studien wird ein großer horizontaler Aluminiumblock mit einem thermischen Gradienten verwendet, während der Mechanismus zur Erzeugung dieses Gradienten variiert, einschließlich Heiz- / Kühlblöcken, Wasserbädern usw. In diesen Fällen wird der Temperaturgradient auf der Oberfläche des Aluminiumblocks erzeugt (und nicht auf der Lufttemperatur in einem Käfig). Folglich schränken die meisten (aber nicht alle) alternativen Techniken die Flugfähigkeit von Insekten stärker ein als dieses Protokoll. Hier können Insekten relativ frei zwischen Käfigen fliegen, was einen realistischeren Ausdruck des natürlichen Verhaltens bei der Wahl ermöglicht. Es wäre sogar möglich, diese experimentelle Apparatur mit größeren Käfigen und Inkubatoren, zum Beispiel für größere Insekten, zu vergrößern.
Neben dem natürlichen Verhaltensvorteil zeigen wir auch eine sehr hohe Temperaturgleichmäßigkeit innerhalb der beiden Kammern, was eine einfache Bewertung und eine klare Auswahl von zwei großen Einzeltemperaturkammern ermöglicht. Die Verwendung eines binären großen Kammerdesigns wie dieses kann das Rauschen in den Daten reduzieren, wobei beispielsweise bei einem Gradientenapparat jede zufällige Bewegung der Insekten die Position auf dem Gradienten und damit ihre wahrgenommene Temperaturpräferenz ändert.
Die hier beschriebene Technik ist zudem sehr einfach und kostengünstig. Diese Technik benötigt keine zusätzlichen Geräte zum Einstellen der Temperaturen (z. B. ein Wasserbad10 und/oder eine Heizplatte 11,12,13,14,15), keine Spezialausrüstung außer einem geschnittenen Acrylrohr und Bohrlöchern und keine Kamera 18,19 oder ausgeklügelte Software 19 zur Analyse. Solche Komponenten, die in anderen Techniken verwendet werden, können teuer sein und / oder erfordern erhebliches Fachwissen und Tests, um Experimente zu beginnen.
Diese Technik kann auch mit verschiedenen Geräten repliziert werden, die Batterien verwenden, wenn keine externe Stromversorgung vorhanden ist, was das System ideal für Experimente im Feld macht. Darüber hinaus könnte das gleiche Gerät leicht modifiziert werden, um andere binäre Wahlpräferenzsituationen wie Hell versus Dunkel, hohe / niedrige Luftfeuchtigkeit usw. entweder im Labor oder im Feld zu untersuchen.
Die Apparatur in voller Größe im Protokoll ist deutlich kleiner als Temperaturgradienten-Setups, was einen einfacheren Einbau in ein BSL 3-Handschuhfach wie oben beschrieben ermöglicht. Außerdem sind die Insekten leichter einzudämmen, da sie am Ende des Experiments mit CO2 niedergeschlagen werden können und die Käfige nach der Trennung von der Brücke schnell wieder verschlossen werden können. Diese Containment-Vorteile sind ideal für BSL 3-Arbeiten.
Wir erkennen jedoch an, dass unsere Apparatur nur eine binäre Entscheidung und nicht eine freie Wahl entlang eines Gradienten zulässt, was je nach Anwendung zusätzliche Durchläufe erfordern kann, um optimale Temperaturen zu identifizieren.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AHR dankt Majlis Amanah Rakyat (MARA) für die finanzielle Unterstützung.
Materials
| Acrylic tube (Bridge) | Perspex | 900 mm OD | Size (Length x diameter): 8 cm x 9 cm; 1 cm bigger than the size of the hole in front of the incubator. Size of the hole on top: 1.6 cm |
| Carbon dioxide (CO2) inflator | Peaken | B08HM2BDDB | Any CO2 pen will work |
| Digital Incubator (×2) | VWR | VWR INCU-Line 1L 10 (390-0384) | Size of hole in front of incubator: 8 cm diameter. Holes need to be position in the center and have the same exact position on both incubators to allow alignment of bridge.This should be pre-drilled using a standard 8 cm ‘holesaw’ drill bit. Incubator must be just large enough to contain one mosquito cage. |
| Mechanical aspirator (for mosquitoes) | Watkins and Doncaster | E710 | Ideal barrel size 50 x 28 mm and tube diameter 9mm. |
| Mosquito cage (×3; two for the experiments, one for storing insects) | BugDorm | BD4S1515 | Size: 17.5 cm x 17.5 cm x 17.5 cm with 12 cm sleeve opening. Mesh material : Knitted nylon |
| Plastic funnel | Diameter of opening = 5 cm Length of funnel = 5 cm Diameter of aperture = 1 cm |
||
| Plastic Pocket Pooter (for Drosophila or small insects) | Watkins and Doncaster | E714 | Manual/mouth aspirated |
| Rubber band or Reusable cable tie | Either, depending on preference. | ||
| Temperature probe | Eidyer | B07J4T1VQZ | Any thermometer with at least 100 cm narrow wire probe |
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