تحديد درجة حرارة تفضيل البعوض والحرارة الخارجية الأخرى
Summary
تتمتع الحشرات بنطاق درجة حرارة بيئي مثالي تسعى إلى البقاء فيه ، ويمكن للعديد من العوامل الخارجية والداخلية تغيير هذا التفضيل. هنا ، نصف طريقة فعالة من حيث التكلفة وبسيطة لدراسة اختيار درجة الحرارة ، والتي تسمح للحشرات بإظهار سلوكياتها الطبيعية بحرية.
Abstract
معظم الحشرات وغيرها من الحرارة الخارجية لها نافذة درجة حرارة مثالية ضيقة نسبيا ، ويمكن أن يكون للانحراف عن الأمثل تأثيرات كبيرة على لياقتها البدنية ، فضلا عن خصائص أخرى. وبالتالي ، فإن العديد من هذه الحرارة الخارجية تبحث عن نطاق درجة الحرارة الأمثل. على الرغم من أن تفضيلات درجة حرارة البعوض والحشرات الأخرى قد تمت دراستها جيدا ، إلا أن الإعداد التجريبي التقليدي يتم باستخدام تدرج درجة الحرارة على سطح من الألومنيوم في مساحة مغلقة للغاية. في بعض الحالات ، يقيد هذا الجهاز العديد من السلوكيات الطبيعية ، مثل الطيران ، والتي قد تكون مهمة في اختيار التفضيلات.
الهدف من هذه الدراسة هو ملاحظة تفضيل الحشرات لدرجة حرارة الهواء باستخدام جهاز من غرفتين مع مساحة كافية للطيران. تتكون الغرفتان من حاضنات مستقلة يتم التحكم في درجة حرارتها ، ولكل منها فتحة كبيرة. ترتبط الحاضنات بهذه الفتحات باستخدام جسر أكريليك قصير. يوجد داخل الحاضنات قفصان شبكيان ، مرتبطان عبر الفتحات والجسر ، مما يسمح للحشرات بالطيران بحرية بين الظروف المختلفة. يعمل جسر الأكريليك أيضا كتدرج في درجة الحرارة بين الحاضنتين.
نظرا للمساحة الواسعة في القفص وسهولة البناء ، يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة أي حرارة خارجية صغيرة و / أو أي تلاعب قد يغير تفضيل درجة الحرارة بما في ذلك التلاعب بالأعضاء الحسية ، والنظام الغذائي ، ونباتات الأمعاء ، ووجود التعايش الداخلي عند مستويات السلامة الحيوية 1 أو 2 (BSL 1 أو 2). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الجهاز لدراسة عدوى مسببات الأمراض باستخدام مزيد من الاحتواء (على سبيل المثال ، داخل خزانة السلامة البيولوجية) في BSL 3.
Introduction
يمكن للكائنات الحية أن تعيش وتتكاثر فقط ضمن نطاق تحملها الحراري. نظرا لاختلاف درجة الحرارة البيئية بسبب تغير الفصول والاحترار العالمي ، يجب على الأنواع التكيف والاستجابة وفقا لذلك لضمان بقائها. وهذا يشمل الحرارة الخارجية ، حيث تكون درجة حرارة الجسم في حالة توازن مع البيئة1. وبالتالي ، فإن كل حشرة لها نطاق درجة حرارة بيئية مثالي خاص بها والتي تسعى إلى البقاء في حدود2.
درجة الحرارة هي أحد العوامل المهمة المستخدمة للتنبؤ بتوزيع ومدى الحشرات3،4،5 ، ومراقبة العلاقات بين مسببات الأمراض والحشرات6،7 وتأثير العوامل الخارجية على لياقة الحرارة الخارجية مثل عمر البالغين ، والخصوبة ، ومعدل التغذية8،9.
بحثت الدراسات السابقة في درجة الحرارة المفضلة للحرارة الخارجية بإعدادات مختلفة. الأكثر شيوعا هو استخدام كتلة كبيرة من الألومنيوم إما مع حمام مائي مبرد أو ساخن 10 ، أو حمام جليدي وعنصر سخان قابل للبرمجة11 ، أو ألواح باردة وساخنة12,13 ، أو ألواح منظم حراري 14,15 ، أو حزمة حرارية وحزمة ثلج 16 في أي من الطرفين لإنشاء تدرج في درجة الحرارة. بالإضافة إلى ذلك ، استخدمت دراسات أخرى أيضا حاضنة تدرج درجة الحرارة لدراسة نمو البكتيريا المختارة 17 وتركيب قضيب من الألومنيوم على جهاز كهروحراري (يتم تسخينه وتبريده في النهايات) لمراقبة التفضيل الحراري لذبابة الفاكهة18,19.
ومع ذلك ، فإن المنهجية البديلة المقترحة هنا لها مزايا كبيرة لبعض تطبيقات الحشرات. أولا ، تتطلب الحلول الأخرى بناء كاملا من الصفر بالمواد الأساسية ، بما في ذلك صفائح الألمنيوم ، وبناء غرف أكريليك للحشرات ، وغالبا ما يكون إعداد الكاميرا والبرامج المتخصصة ؛ قد يكون هذا مكلفا ويستغرق وقتا طويلا في الإعداد. ثانيا ، تعتمد العديد من الأجهزة البديلة على تدرج درجة الحرارة على السطح (على عكس درجة حرارة الهواء). وبالتالي ، فإن الغرفة التي تدرس فيها الحشرات غالبا ما تكون ضيقة جدا (على سبيل المثال ، تدرجات طويلة 24 سم بعرض 2 سم وعمق 1 سم فقط16) ، مما قد يمنع السلوكيات الطبيعية ، مثل الطيران ، والتي تعتبر ضرورية للحركة الطبيعية للحشرات وبالتالي ضرورية في اختيار درجة الحرارة المفضلة. بعض الدراسات تقيس درجة حرارة الهواء. ومع ذلك ، فإن تسجيل الاختيار لا يزال ينطوي على حساب عدد البعوض الذي يهبط على عناصر بلتيير بدلا من الحشرات التي تطير بحرية في الأقفاص20.
في هذه الدراسة ، وصفنا إعدادا أبسط ، يستخدم معدات قياسية معدلة إلى الحد الأدنى ويوفر للحشرات مساحة كافية للطيران والتنقل دون عوائق نسبيا في قفص صيانة مستعمرة قياسي الحجم. علاوة على ذلك ، بدلا من الاعتماد على التدرج ، يستخدم البروتوكول قسمين كبيرين نسبيا من درجة الحرارة الداخلية المتسقة ، مما يسمح بالتجوال الطبيعي للحشرات في درجة حرارتها المفضلة وتسجيل ثنائي بسيط. ومن ثم ، فإن الجهاز والبروتوكول الموصوفين هنا يوفران وسيلة منخفضة التكلفة وبسيطة لدراسة تفضيل درجة حرارة البعوض في بيئة أقل انسدادا وأكثر واقعية.
يتضمن البروتوكول تحضير الحشرات قبل التجربة متبوعا بإعداد الجهاز المكون من غرفتين. تشمل الخطوات الإضافية وضع الحشرات في الجهاز للسماح باختيار درجة الحرارة وتسجيل النتائج. لتوضيح الطريقة هنا ، اخترنا درجة الحرارة المثلى (التربية القياسية) للحشرات ، 27 درجة مئوية لل Aedes aegypti ، 25 درجة مئوية لذبابة الفاكهة الميلانوجاستر ، ودرجة حرارة طاردة أعلى لكلا النوعين من الحشرات ، 30 درجة مئوية و 28 درجة مئوية ، على التوالي. يتم إعطاء الحشرات 30 دقيقة لاختيار الغرفة المفضلة. وتبين أن هذه المرة كافية، وأن المدة الأطول لم تغير النتائج؛ ومع ذلك ، قد يتم تمديد هذا اعتمادا على الأنواع / درجة الحرارة / المتغيرات الأخرى حسب الحاجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف الدراسة طريقة جديدة لمراقبة تفضيل درجة الحرارة في البعوض. في هذه الطريقة ، يتم إطلاق البعوض في أنبوب متصل بحاضنتين مع درجات حرارة يمكن التحكم فيها بشكل مستقل. وبهذه الطريقة ، يسمح للبعوض بالاختيار بحرية بين درجتي حرارة دون تعطيل سلوكياته الطبيعية وآلية التعبير عن هذا الاختيار (على سبيل المثال ، الطيران).
استخدمت تجربتنا التمثيلية الأولى درجة الحرارة المثلى للبعوض البالغة 27 درجة مئوية في كلا المجلسين. خلال تكرار هذه التجربة ، لوحظ أن البعوض يطير بحرية بين كلا الأقفاص لمدة 30 دقيقة كاملة ، وفي جميع النسخ المتماثلة ، كانت هناك أعداد متساوية تقريبا في كل من الغرفتين. أكد هذا النية التجريبية للسماح للبعوض بالقدرة على الاختيار بحرية بين الأقفاص أثناء عرض سلوكياته الطبيعية (الطيران). على العكس من ذلك ، استخدمت التجربة التمثيلية الثانية درجة حرارة مثالية جذابة تبلغ 27 درجة مئوية في غرفة واحدة ودرجة حرارة دون المستوى الأمثل وبالتالي درجة حرارة صد تبلغ 30 درجة مئوية في الغرفة الثانية. كما هو متوقع ، اختار البعوض باستمرار غرفة درجة الحرارة المثلى ذات الأهمية العالية ، حتى عندما قمنا بتبديل الحاضنات لتجنب التحيز.
اختبرنا أيضا الإعداد لحشرة مختلفة ، D. melanogaster (ذباب الفاكهة) ، تمثل كائنا نموذجيا خارجيا آخر. تم ضبط إحدى الغرف على درجة الحرارة المثلى ل D. melanogaster ، 25 درجة مئوية ، وتم ضبط الأخرى على 3 درجات مئوية أعلى ، 28 درجة مئوية. على غرار البعوض ، فضل ذباب الفاكهة أيضا درجة حرارته المثلى وتجنب الغرفة الأكثر دفئا. هذا يدل على أن البروتوكول مناسب لمجموعة من الحرارة الخارجية.
وصف الخطوات الحرجة في البروتوكول
الخطوة الحاسمة الرئيسية في البروتوكول هي التعامل مع الحشرات ، لأنها تولد إمكانية هروب الحشرات. يمكن منع ذلك عن طريق تحديد أنه لا توجد ثقوب كبيرة بما يكفي للهروب في الأقفاص المستخدمة ، وأن الأربطة المطاطية / روابط الكابلات المستخدمة لتأمين الأكمام الشبكية بالجسر ضيقة ، وأن غطاء فتحة إدخال الحشرات على الجسر متصل ومغلق بإحكام.
من الضروري أيضا التأكد من عدم هروب الحشرات قبل التجربة أو بعدها ، خاصة عندما تكون الحشرات مطلوبة لإجراء التجارب النهائية أو النقاط الزمنية اللاحقة لخيارات درجات الحرارة المختلفة. يمكن القيام بذلك عن طريق تخدير الحشرات قبل وضعها في جسر الأكريليك (باستخدام الثلج لذبابة الفاكهة و CO 2 للبعوض) وإطلاق CO2 في الجسر لهدم الحشرات بعد التجارب ، قبل الحساب. استخدام CO2 مثالي للبعوض لأنه لن يؤثر على النتائج السلوكية21. في الذباب ، يمكن أن يؤدي التعرض لثاني أكسيد الكربون2 إلى تغيير سلوك الطيران23 ، وبالتالي يوصى باستخدام الثلج22.
يعد عد الحشرات أيضا خطوة حاسمة ، لضمان تساوي أعداد الحشرات قبل التجربة وبعدها للحصول على نتائج دقيقة. من أجل القيام بذلك ، نوصي باستخدام قلم CO2 بمجرد اكتمال التجربة لهدم الحشرات الموجودة في الجسر. سيساعد ذلك في نقل الحشرات إلى جانبي الغرفة ، وبالتالي تقليل عدد الهاربين. نسلط الضوء أيضا في البروتوكول على أنه يمكن القبض على الحشرات في أكمام الأقفاص أثناء فصل الأقفاص. لذلك ، تأكد من فحصها بدقة أثناء العد.
التعديلات المحتملة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لهذه التقنية
تتمثل الصعوبة الرئيسية في هذه التقنية في الشبكة المرنة لأكمام القفص مما يؤدي إلى فجوات أو أماكن للاختباء وبالتالي هروب الحشرات أو محاصرتها. هناك بعض التعديلات المحتملة ، إذا لزم الأمر ، لتحسين التقنية. نقترح استخدام شريطين مطاطيين أو أكثر لضمان تأمين الجسر بشكل صحيح بين الغرف دون ترك أي مساحة محتملة للحشرات (شبكة فضفاضة تخلق مساحة للاختباء للحشرات). ننصح أيضا بالعناية الخاصة بسحب الأكمام الشبكية مشدودا ، كما هو موضح في الخطوة 2.6 ، عند تجميع الجهاز.
عادة ما يتم تسخين حاضنات عامل الشكل الصغير فقط (أي لا يوجد بها تبريد نشط) ، كما كان الحال بالنسبة للحاضنات المستخدمة هنا. وبالتالي ، فإن استخدام درجات حرارة حول أو أقل من درجة حرارة الغرفة المحيطة سيتطلب إجراء التجربة في غرفة باردة لضمان انخفاض درجات الحرارة المحددة للحاضنات حسب الرغبة.
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا استخدام هذا الإعداد ل BSL 3 ، حيث تكون هناك حاجة إلى خزانة للسلامة البيولوجية من الفئة الثالثة (صندوق القفازات). في هذه الحالة ، يجب أن يكون صندوق القفازات كبيرا بما يكفي ليناسب الجهاز بأكمله. تعتبر التجربة الموصوفة في هذا البروتوكول مثالية للتجارب في صندوق القفازات لأن كل ما هو مطلوب سيتم احتواؤه داخل صندوق القفازات ، والأهم من ذلك ، أن إمكانية هروب الحشرات ضئيلة.
أخيرا ، هناك مساحة كافية في الحاضنات لإضافة ضوء خارجي أو مصدر رطوبة دون التأثير على الحشرات في الأقفاص. اعتمادا على أنواع الحشرات أو التصميم التجريبي ، يمكن وضع مصباح LED بسمك 1 سم بسهولة أعلى القفص داخل إحدى الحاضنات أو كليهما. يمكن أن يكون توفير الضوء لكليهما وتقديم خيار درجة الحرارة بروتوكولا أكثر واقعية لبعض التصميمات التجريبية الحساسة للضوء ، أو أن توفير الضوء (أو الرطوبة) فقط لغرفة واحدة هو تعديل محتمل للبروتوكول لتقييم اختيار الضوء / الرطوبة.
مزايا هذه التقنية في سياق فحوصات تفضيل درجة الحرارة ذات الاختيار المزدوج
تقدم الطريقة الموصوفة هنا بديلا لطريقة تدرج درجة الحرارة التقليدية الموصوفة في الدراسات السابقة10،13،14،16. في معظم هذه الدراسات ، يتم استخدام كتلة ألمنيوم أفقية كبيرة ذات تدرج حراري ، بينما تختلف آلية توليد هذا التدرج ، بما في ذلك كتل التدفئة / التبريد ، والحمامات المائية ، وما إلى ذلك. في هذه الحالات ، يتم إنتاج تدرج درجة الحرارة على سطح كتلة الألومنيوم (بدلا من درجة حرارة الهواء في قفص). وبالتالي ، فإن معظم التقنيات البديلة (وليس كلها) تقيد قدرة الحشرات على الطيران أكثر من هذا البروتوكول. هنا ، يمكن للحشرات أن تطير بحرية نسبية بين الأقفاص ، مما يسمح بتعبير أكثر واقعية عن السلوكيات الطبيعية في الاختيار. سيكون من الممكن حتى توسيع نطاق هذا الجهاز التجريبي باستخدام أقفاص وحاضنات أكبر ، على سبيل المثال ، للحشرات الكبيرة.
بالإضافة إلى ميزة السلوك الطبيعي ، نظهر أيضا توحيدا في درجات الحرارة العالية جدا داخل الغرفتين ، مما يتيح التسجيل البسيط والاختيار الواضح لغرفتين كبيرتين بدرجة حرارة واحدة. قد يؤدي استخدام تصميم غرفة كبيرة ثنائية مثل هذا إلى تقليل الضوضاء في البيانات ، حيث ، على سبيل المثال على جهاز التدرج ، فإن أي حركة عرضية للحشرات ستغير موضعها على التدرج وبالتالي تفضيل درجة الحرارة المتصورة.
التقنية الموصوفة هنا هي أيضا بسيطة جدا ومنخفضة التكلفة. لا تحتاج هذه التقنية إلى أجهزة إضافية لضبط درجات الحرارة (أي حمام مائي 10 و / أو لوح تسخين 11،12،13،14،15) ، ولا توجد معدات متخصصة إلى جانب أنبوب أكريليك مقطوع وثقوب محفورة ، ولا توجد كاميرا18،19 أو برامج متطورة 19 للتحليل. يمكن أن تكون هذه المكونات المستخدمة في تقنيات أخرى باهظة الثمن و / أو تتطلب خبرة كبيرة واختبارا لبدء التجارب.
يمكن أيضا تكرار هذه التقنية مع أجهزة مختلفة تستخدم البطاريات إذا لم يكن هناك مصدر طاقة خارجي ، مما يجعل النظام مثاليا لإجراء التجارب في هذا المجال. علاوة على ذلك ، يمكن تعديل نفس الجهاز بشكل طفيف لدراسة حالات تفضيل الاختيار الثنائي الأخرى ، مثل الضوء مقابل الظلام ، والرطوبة العالية / المنخفضة ، وما إلى ذلك ، سواء في المختبر أو الحقل.
الجهاز كامل الحجم في البروتوكول أصغر بكثير من إعدادات تدرج درجة الحرارة ، مما يسمح بملاءمة أسهل داخل صندوق قفازات BSL 3 كما هو موضح أعلاه. علاوة على ذلك ، يسهل احتواء الحشرات ، حيث يمكن هدمها باستخدام CO2 في نهاية التجربة ، ويمكن إعادة إغلاق الأقفاص بسرعة بعد الانفصال عن الجسر. مزايا الاحتواء هذه مثالية لعمل BSL 3.
ومع ذلك ، فإننا نقر بأن أجهزتنا تسمح فقط باتخاذ قرار ثنائي بدلا من الاختيار الحر على طول التدرج ، والذي ، اعتمادا على التطبيق ، قد يتطلب عمليات تشغيل إضافية لتحديد درجات الحرارة المثلى.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر الصندوق بدعم التمويل من مجلس أمانة راكيات (MARA).
Materials
| Acrylic tube (Bridge) | Perspex | 900 mm OD | Size (Length x diameter): 8 cm x 9 cm; 1 cm bigger than the size of the hole in front of the incubator. Size of the hole on top: 1.6 cm |
| Carbon dioxide (CO2) inflator | Peaken | B08HM2BDDB | Any CO2 pen will work |
| Digital Incubator (×2) | VWR | VWR INCU-Line 1L 10 (390-0384) | Size of hole in front of incubator: 8 cm diameter. Holes need to be position in the center and have the same exact position on both incubators to allow alignment of bridge.This should be pre-drilled using a standard 8 cm ‘holesaw’ drill bit. Incubator must be just large enough to contain one mosquito cage. |
| Mechanical aspirator (for mosquitoes) | Watkins and Doncaster | E710 | Ideal barrel size 50 x 28 mm and tube diameter 9mm. |
| Mosquito cage (×3; two for the experiments, one for storing insects) | BugDorm | BD4S1515 | Size: 17.5 cm x 17.5 cm x 17.5 cm with 12 cm sleeve opening. Mesh material : Knitted nylon |
| Plastic funnel | Diameter of opening = 5 cm Length of funnel = 5 cm Diameter of aperture = 1 cm |
||
| Plastic Pocket Pooter (for Drosophila or small insects) | Watkins and Doncaster | E714 | Manual/mouth aspirated |
| Rubber band or Reusable cable tie | Either, depending on preference. | ||
| Temperature probe | Eidyer | B07J4T1VQZ | Any thermometer with at least 100 cm narrow wire probe |
References
- Wright, R. K., Cooper, E. L. Temperature effects on ectotherm immune responses. Developmental & Comparative Immunology. 5, 117-122 (1981).
- Deal, J. The temperature preferendum of certain insects. The Journal of Animal Ecology. 10 (2), 323-356 (1941).
- Hongoh, V., Berrang-Ford, L., Scott, M. E., Lindsay, L. R. Expanding geographical distribution of the mosquito, Culex pipiens, in Canada under climate change. Applied Geography. 33, 53-62 (2012).
- Beck-Johnson, L. M., et al. The importance of temperature fluctuations in understanding mosquito population dynamics and malaria risk. Royal Society Open Science. 4 (3), 160969 (2017).
- Erraguntla, M., et al. Predictive model for microclimatic temperature and its use in mosquito population modeling. Scientific Reports. 11 (1), 18909 (2021).
- Shapiro, L. L., Whitehead, S. A., Thomas, M. B. Quantifying the effects of temperature on mosquito and parasite traits that determine the transmission potential of human malaria. PLoS Biology. 15 (10), 20033489 (2017).
- Zhang, Y., et al. Decline in symbiont-dependent host detoxification metabolism contributes to increased insecticide susceptibility of insects under high temperature. The ISME Journal. 15 (12), 3693-3703 (2021).
- Amarasekare, P., Savage, V. A framework for elucidating the temperature dependence of fitness. The American Naturalist. 179 (2), 178-191 (2012).
- Buckley, L. B., Nufio, C. R. Elevational clines in the temperature dependence of insect performance and implications for ecological responses to climate change. Conservation Physiology. 2 (1), 035 (2014).
- MacLean, H. J., et al. Temperature preference across life stages and acclimation temperatures investigated in four species of Drosophila. Journal of Thermal Biology. 86, 102428 (2019).
- Castañeda, L. E., Romero-Soriano, V., Mesas, A., Roff, D. A., Santos, M. Evolutionary potential of thermal preference and heat tolerance in Drosophila subobscura. Journal of Evolutionary Biology. 32 (8), 818-824 (2019).
- Weldon, C. W., Terblanche, J. S., Bosua, H., Malod, K., Chown, S. L. Male Mediterranean fruit flies prefer warmer temperatures that improve sexual performance. Journal of Thermal Biology. 108, 103298 (2022).
- Sayeed, O., Benzer, S. Behavioral genetics of thermosensation and hygrosensation in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93 (12), 6079-6084 (1996).
- Verhulst, N. O., Brendle, A., Blanckenhorn, W. U., Mathis, A. Thermal preferences of subtropical Aedes aegypti and temperate Ae. japonicus mosquitoes. Journal of Thermal Biology. 91, 102637 (2020).
- Ziegler, R., Blanckenhorn, W. U., Mathis, A., Verhulst, N. O. Video analysis of the locomotory behaviour of Aedes aegypti and Ae. japonicus mosquitoes under different temperature regimes in a laboratory setting. Journal of Thermal Biology. 105, 103205 (2022).
- Blanford, S., Read, A. F., Thomas, M. B. Thermal behaviour of Anopheles stephensi in response to infection with malaria and fungal entomopathogens. Malaria Journal. 8, 72 (2009).
- Nakae, T. Temperature-related anomalies in the growth of selected bacteria. Journal of Dairy Science. 54 (12), 1780-1783 (1971).
- Rajpurohit, S., Schmidt, S. P. Measuring thermal behavior in smaller insects: A case study in Drosophila melanogaster demonstrates effects of sex, geographic origin, and rearing temperature on adult behavior. Fly. 10 (4), 149-161 (2016).
- Truitt, A. M., Kapun, M., Kaur, R., Miller, W. J. Wolbachia modifies thermal preference in Drosophila melanogaster. Environmental Microbiology. 21 (9), 3259-3268 (2019).
- Reinhold, J. M., et al. Species-specificity in thermopreference and CO2-gated heat-seeking in Culex mosquitoes. Insects. 13 (1), 92 (2022).
- Lin, C. S., Georghiou, G. P. Tolerance of mosquito larvae and pupae to carbon dioxide anesthesia. Mosquito News. 36 (4), 460-461 (1976).
- Ito, F., Awasaki, T. Comparative analysis of temperature preference behavior and effects of temperature on daily behavior in 11 Drosophila species. Scientific Reports. 12 (1), 1-15 (2022).
- Bartholomew, N., Burdett, J., VandenBrooks, J., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Scientific Reports. 5, 15298 (2015).
