Sivrisineklerin ve diğer ektotermlerin sıcaklık tercihinin belirlenmesi
Summary
Böcekler, içinde kalmaya çalıştıkları optimal bir çevresel sıcaklık aralığına sahiptir ve birçok dış ve iç faktör bu tercihi değiştirebilir. Burada, böceklerin doğal davranışlarını özgürce sergilemelerini sağlayan sıcaklık seçimini incelemek için uygun maliyetli ve basit bir yöntem açıklıyoruz.
Abstract
Çoğu böcek ve diğer ektotermler nispeten dar bir optimal sıcaklık penceresine sahiptir ve optimalarından sapma, diğer özelliklerin yanı sıra uygunlukları üzerinde de önemli etkilere sahip olabilir. Sonuç olarak, bu tür birçok ektoterm, optimum sıcaklık aralıklarını arar. Sivrisineklerin ve diğer böceklerin sıcaklık tercihleri iyi çalışılmış olmasına rağmen, geleneksel deney düzeneği, oldukça kapalı bir alanda alüminyum bir yüzey üzerinde bir sıcaklık gradyanı kullanılarak gerçekleştirilir. Bazı durumlarda, bu ekipman tercih seçiminde önemli olabilecek uçma gibi birçok doğal davranışı kısıtlar.
Bu çalışmanın amacı, uçuş için yeterli alana sahip iki odacıklı bir aparat kullanarak hava sıcaklığı için böcek tercihini gözlemlemektir. İki oda, her biri geniş bir açıklığa sahip bağımsız sıcaklık kontrollü inkübatörlerden oluşur. İnkübatörler bu açıklıklarla kısa bir akrilik köprü kullanılarak bağlanır. İnkübatörlerin içinde, açıklıklar ve köprü aracılığıyla birbirine bağlanan ve böceklerin farklı koşullar arasında serbestçe uçmalarını sağlayan iki ağ kafesi vardır. Akrilik köprü ayrıca iki inkübatör arasında bir sıcaklık gradyanı görevi görür.
Kafesteki geniş alan ve kolay yapım nedeniyle, bu yöntem duyu organı manipülasyonu, diyet, bağırsak florası ve biyogüvenlik seviyeleri 1 veya 2’de (BSL 1 veya 2) endosimbiyont varlığı dahil olmak üzere sıcaklık tercihini değiştirebilecek herhangi bir küçük ektotermi ve / veya herhangi bir manipülasyonu incelemek için kullanılabilir. Ek olarak, cihaz, BSL 3’te daha fazla muhafaza (örneğin, bir biyogüvenlik kabininin içinde) kullanılarak patojen enfeksiyonunun incelenmesi için kullanılabilir.
Introduction
Organizmalar sadece termal tolerans aralıkları içinde yaşayabilir ve çoğalabilirler. Mevsimlerin değişmesi ve küresel ısınma nedeniyle çevresel sıcaklık değiştiğinden, türler hayatta kalmalarını sağlamak için buna göre adapte olmalı ve yanıt vermelidir. Bu, vücut sıcaklığının çevre ile dengede olduğu ektotermleri içerir1. Bu nedenle, her böcek,2 içinde kalmaya çalıştıkları kendi optimal çevresel sıcaklık aralığına sahiptir.
Sıcaklık, böceklerin dağılımını ve aralığını tahmin etmede kullanılan önemli faktörlerden biridir 3,4,5, patojen-böcek ilişkilerini gözlemlemek 6,7 ve dış faktörlerin yetişkin yaşam süreleri, doğurganlıkları ve beslenme hızları gibi ektotermlerin uygunluğu üzerindeki etkisi 8,9.
Önceki çalışmalar, ektotermlerin tercih edilen sıcaklığını farklı kurulumlarla araştırmıştır. En yaygın olanı, bir sıcaklık gradyanı oluşturmak için soğutulmuş veya ısıtılmış bir su banyosu 10, bir buz banyosu ve programlanabilir ısıtıcı elemanı11, soğuk ve sıcak plakalar12,13, termal regülatör plakaları 14,15 veya bir ısı paketi ve buz paketi 16 ile büyük bir alüminyum blok kullanmaktır. Ek olarak, diğer çalışmalar da seçilen bakteri17’nin büyümesini incelemek için bir sıcaklık gradyanı inkübatörü kullanmış ve Drosophila melanogaster18,19’un termal tercihini gözlemlemek için termoelektrik bir cihaza (uçlarında ısıtılmış ve soğutulmuş) bir alüminyum çubuk monte etmiştir.
Bununla birlikte, burada önerilen alternatif metodoloji, bazı böcek uygulamaları için önemli avantajlara sahiptir. İlk olarak, diğer çözümler, alüminyum levhalar, böcekler için akrilik odalar inşa etmek ve genellikle bir kamera kurulumu ve uzman yazılım dahil olmak üzere temel malzemelerle sıfırdan tam inşaat gerektirir; bunun kurulumu pahalı ve zaman alıcı olabilir. İkincisi, birçok alternatif aparat, bir yüzeydeki sıcaklık gradyanına dayanır (hava sıcaklığının aksine). Sonuç olarak, böceklerin incelendiği oda genellikle çok dardır (örneğin, sadece 2 cm genişliğe ve 1 cm derinliğe sahip 24 cm uzunluğundaki gradyanlar16), bu da böceklerin normal hareketliliği için gerekli olan ve dolayısıyla tercih edilen bir sıcaklığın seçilmesinde zorunlu olan uçuş gibi doğal davranışları önleyebilir. Bazı çalışmalar hava sıcaklığını ölçer; Bununla birlikte, seçim puanlaması hala kafeslerde serbestçe uçan böceklerin aksine, Peltier elementlerine inen sivrisineklerin sayısını saymayı içerir20.
Bu çalışmada, minimal modifiye edilmiş standart ekipman kullanan ve böceklere standart boyutlu bir koloni bakım kafesinde nispeten engelsiz uçmak ve gezinmek için yeterli alan sağlayan daha basit bir kurulum tanımladık. Ayrıca, bir gradyana güvenmek yerine, protokol, böceklerin tercih ettikleri sıcaklıkta doğal dolaşımına ve basit bir ikili puanlamaya izin veren, tutarlı iç sıcaklığın nispeten büyük boyutlu iki bölümünü kullanır. Bu nedenle, burada açıklanan cihaz ve protokol, sivrisinek sıcaklık tercihini daha az engelleyici ve daha gerçekçi bir ortamda incelemek için düşük maliyetli ve basit bir araç sağlar.
Protokol, deneyden önce böceklerin hazırlanmasını ve ardından iki odacıklı cihaz kurulumunu içerir. Diğer adımlar, sıcaklık seçimine ve sonuçların puanlanmasına izin vermek için aparata böceklerin yerleştirilmesini içerir. Buradaki yöntemin bir örneği için, böceklerin optimal (standart yetiştirme) sıcaklığını, Aedes aegypti için 27 ° C, Drosophila melanogaster için 25 ° C ve her iki böcek türü için sırasıyla 30 ° C ve 28 ° C daha yüksek bir itme sıcaklığını seçtik. Böceklere tercih edilen bir odayı seçmek için 30 dakika verilir. Bu sürenin yeterli olduğu tespit edildi ve daha uzun bir süre sonuçları değiştirmedi; ancak, bu gerektiğinde türe/sıcaklığa/diğer değişkenlere bağlı olarak genişletilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çalışma, sivrisineklerde sıcaklık tercihini gözlemlemek için yeni bir yöntem açıklamaktadır. Bu yöntemde, sivrisinekler bağımsız olarak kontrol edilebilir sıcaklıklara sahip iki inkübatöre bağlı bir tüpe salınır. Bu şekilde, sivrisineklerin doğal davranışlarını ve bu seçimi ifade etme mekanizmalarını (örneğin, uçmak) bozmadan iki sıcaklık arasında serbestçe seçim yapmalarına izin verilir.
İlk temsili deneyimiz, her iki odada da sivrisinek optimum sıcaklığı 27 ° C’yi kullandı. Bu deneyin tekrarları sırasında, sivrisineklerin 30 dakika boyunca her iki kafes arasında serbestçe uçtuğu gözlemlendi ve tüm kopyalarda, iki odanın her birinde neredeyse eşit sayılar vardı. Bu, sivrisineklerin doğal davranışlarını sergilerken (uçma) kafesler arasında serbestçe seçim yapmalarına izin vermenin deneysel niyetini doğruladı. Tersine, ikinci temsili deney, bir odada 27 ° C’lik çekici optimum sıcaklığı ve ikinci odada 30 ° C’lik bir optimal olmayan ve dolayısıyla itici sıcaklığı kullandı. Beklendiği gibi, sivrisinekler, önyargıyı önlemek için inkübatörleri değiştirdiğimizde bile, sürekli olarak en uygun sıcaklık odasını yüksek öneme sahip olarak seçtiler.
Ayrıca, başka bir ektotermik model organizmayı temsil eden farklı bir böcek olan D. melanogaster (meyve sinekleri) için kurulumu test ettik. Bir oda D. melanogaster’in optimum sıcaklığına, 25 ° C’ye, diğeri ise 3 ° C daha yüksek, 28 ° C’ye ayarlandı. Sivrisineklere benzer şekilde, meyve sinekleri de optimal sıcaklıklarını tercih ettiler ve daha sıcak odadan kaçındılar. Bu, protokolün bir dizi ektotermler için uygun olduğunu göstermektedir.
Protokoldeki kritik adımların açıklaması
Protokoldeki ana kritik adım, böceklerin kaçma olasılığını yarattığı için böcek işlemedir. Bu, kullanılan kafeslerde kaçış için yeterince büyük delikler olmadığı, ağ manşonlarını köprüye sabitlemek için kullanılan lastik bantların / kablo bağlarının sıkı olduğu ve köprü üzerindeki böcek yerleştirme deliğinin kapağının güvenli bir şekilde tutturulduğu ve kapatıldığı tespit edilerek önlenebilir.
Böceklerin deneyden önce veya sonra kaçmamasını sağlamak da çok önemlidir, özellikle de böcekler aşağı akış deneyleri için veya çeşitli sıcaklık seçimleri için daha sonraki zaman noktaları için gerekli olduğunda. Bu, böcekleri akrilik köprüye yerleştirmeden önce anestezi yaparak ( Drosophila için buz ve sivrisinekler için CO 2 kullanarak) ve hesaplamalardan önce deneylerden sonra böcekleri devirmek için CO2’yi köprüye bırakarak yapılabilir. CO2’nin kullanımı sivrisinekler için idealdir, çünkü davranışsal sonuçları etkilemez21. Sineklerde, CO2’ye maruz kalmak uçuş davranışlarını değiştirebilir23, bu nedenle buz22’nin kullanılması önerilir.
Böceklerin sayımı, doğru sonuçlar için deneyden önce ve sonra böcek sayısının eşit olmasını sağlamak için kritik bir adımdır. Bunu yapmak için, köprüde bulunan böcekleri yıkmak için deney tamamlandıktan sonra bir CO2 kalemi kullanmanızı öneririz. Bu, böcekleri odanın her iki tarafına da taşımaya yardımcı olacak, böylece kaçış sayısını azaltacaktır. Protokolde ayrıca, böceklerin kafes ayırma sırasında kafeslerin kollarında yakalanabileceğini de vurguluyoruz; bu nedenle, sayım sırasında bunların iyice kontrol edildiğinden emin olun.
Potansiyel değişiklikler ve tekniğin sorun giderme
Bu teknikle ilgili temel zorluk, kafes manşonlarının esnek ağı, boşluklara veya saklanma yerlerine ve dolayısıyla böceklerin kaçmasına veya yakalanmasına neden olur. Gerekirse tekniği geliştirmek için bazı potansiyel değişiklikler vardır. Köprünün böcekler için herhangi bir potansiyel alan bırakmadan odalar arasında düzgün bir şekilde sabitlenmesini sağlamak için iki veya daha fazla lastik bant kullanmanızı öneririz (gevşek ağ, böcekler için bir saklanma alanı oluşturur). Ayrıca, aparatı monte ederken, adım 2.6’da açıklandığı gibi, ağ manşonu gerginliğini çekmeye özellikle dikkat etmenizi öneririz.
Küçük form faktörlü inkübatörler, burada kullanılan inkübatörlerde olduğu gibi, genellikle sadece ısıtılır (yani, aktif soğutmaya sahip değildir). Sonuç olarak, ortam odası sıcaklığının etrafındaki veya altındaki sıcaklıkların kullanılması, inkübatörler için ayarlanan sıcaklıkların istenildiği kadar düşük olmasını sağlamak için deneyin soğuk bir odada yapılmasını gerektirecektir.
Ek olarak, bu kurulum, üçüncü sınıf bir biyogüvenlik kabininin (torpido gözü) gerekli olduğu BSL 3 için de kullanılabilir. Bu durumda, torpido gözünün tüm aparata sığacak kadar büyük olması gerekir. Bu protokolde açıklanan deney, bir torpido gözündeki deneyler için idealdir, çünkü gereken her şey eldiven kutusunun içinde yer alacaktır ve daha da önemlisi, böceklerin kaçma olasılığı minimumdur.
Son olarak, inkübatörlerde, kafeslerdeki böcekleri etkilemeden harici ışık veya nem kaynağı eklemek için yeterli alan vardır. Böcek türüne veya deneysel tasarıma bağlı olarak, 1 cm kalınlığında bir LED lamba, bir veya her iki inkübatörün içindeki kafesin üstüne kolayca yerleştirilebilir. Her ikisine de ışık sağlamak ve bir sıcaklık seçimi sunmak, bazı ışığa duyarlı deneysel tasarımlar için daha gerçekçi bir protokol olabilir veya yalnızca bir odaya ışık (veya nem) sağlamak, ışık / nem seçimini değerlendirmek için protokolde olası bir değişikliktir.
Bu tekniğin çift seçenekli sıcaklık tercihi testleri bağlamında avantajları
Burada açıklanan yöntem, önceki çalışmalarda açıklanan geleneksel sıcaklık gradyanı yöntemine bir alternatif sunar10,13,14,16. Bu çalışmaların çoğunda, termal gradyanlı büyük bir yatay alüminyum blok kullanılırken, bu gradyanı üretme mekanizması, ısıtma / soğutma blokları, su banyoları vb. Dahil olmak üzere değişir. Bu gibi durumlarda, sıcaklık gradyanı alüminyum bloğun yüzeyinde üretilir (bir kafesteki hava sıcaklığı yerine). Sonuç olarak, çoğu (ama hepsi değil) alternatif teknikler, böceklerin uçuş kabiliyetini bu protokolden daha fazla kısıtlamaktadır. Burada, böcekler kafesler arasında nispeten serbestçe uçabilir ve bu da seçimdeki doğal davranışların daha gerçekçi bir şekilde ifade edilmesini sağlar. Bu deneysel cihazı, örneğin daha büyük böcekler için daha büyük kafesler ve inkübatörler kullanarak büyütmek bile mümkün olacaktır.
Doğal davranış avantajına ek olarak, iki oda içinde çok yüksek sıcaklık homojenliği göstererek basit puanlama ve iki büyük tek sıcaklık odasının net bir şekilde seçilmesini sağlıyoruz. Bunun gibi ikili bir büyük oda tasarımının kullanılması, verilerdeki gürültüyü azaltabilir; örneğin, bir gradyan aparatı üzerinde, böceklerin herhangi bir tesadüfi hareketi, gradyan üzerindeki konumu ve dolayısıyla algılanan sıcaklık tercihlerini değiştirecektir.
Burada açıklanan teknik de çok basit ve düşük maliyetlidir. Bu teknik, sıcaklıkları ayarlamak için ekstra cihazlara ihtiyaç duymaz (yani, bir su banyosu 10 ve / veya bir sıcak plaka 11,12,13,14,15), kesilmiş bir akrilik tüp ve delinmiş delikler dışında hiçbir özel ekipman ve kamera18,19 veya sofistike bir yazılım gerektirmez 19 analiz için. Diğer tekniklerde kullanılan bu tür bileşenler pahalı olabilir ve / veya deneylere başlamak için önemli uzmanlık ve test gerektirebilir.
Bu teknik, harici güç kaynağı yoksa pil kullanan farklı cihazlarla da çoğaltılabilir ve bu da sistemi sahada deneyler yapmak için ideal hale getirir. Ayrıca, aynı cihaz, laboratuvarda veya sahada açık ve karanlık, yüksek / düşük nem vb. gibi diğer ikili seçim tercih durumlarını incelemek için biraz değiştirilebilir.
Protokoldeki tam boyutlu aparat, sıcaklık gradyanı kurulumlarından önemli ölçüde daha küçüktür ve yukarıda açıklandığı gibi BSL 3 eldiven kutusunun içine daha kolay oturmasını sağlar. Ayrıca, deneyin sonunda CO2 ile yıkılabildikleri için böceklerin tutulması daha kolaydır ve kafesler köprüden ayrıldıktan sonra hızlı bir şekilde yeniden kapatılabilir. Bu muhafaza avantajları, BSL 3 çalışmaları için idealdir.
Bununla birlikte, cihazımızın, uygulamaya bağlı olarak, optimum sıcaklıkları tanımlamak için ek çalıştırmalar gerektirebilecek bir gradyan boyunca özgür bir seçim yerine yalnızca ikili bir karara izin verdiğini kabul ediyoruz.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AHR, Majlis Amanah Rakyat’ın (MARA) finansman desteğini kabul ediyor.
Materials
| Acrylic tube (Bridge) | Perspex | 900 mm OD | Size (Length x diameter): 8 cm x 9 cm; 1 cm bigger than the size of the hole in front of the incubator. Size of the hole on top: 1.6 cm |
| Carbon dioxide (CO2) inflator | Peaken | B08HM2BDDB | Any CO2 pen will work |
| Digital Incubator (×2) | VWR | VWR INCU-Line 1L 10 (390-0384) | Size of hole in front of incubator: 8 cm diameter. Holes need to be position in the center and have the same exact position on both incubators to allow alignment of bridge.This should be pre-drilled using a standard 8 cm ‘holesaw’ drill bit. Incubator must be just large enough to contain one mosquito cage. |
| Mechanical aspirator (for mosquitoes) | Watkins and Doncaster | E710 | Ideal barrel size 50 x 28 mm and tube diameter 9mm. |
| Mosquito cage (×3; two for the experiments, one for storing insects) | BugDorm | BD4S1515 | Size: 17.5 cm x 17.5 cm x 17.5 cm with 12 cm sleeve opening. Mesh material : Knitted nylon |
| Plastic funnel | Diameter of opening = 5 cm Length of funnel = 5 cm Diameter of aperture = 1 cm |
||
| Plastic Pocket Pooter (for Drosophila or small insects) | Watkins and Doncaster | E714 | Manual/mouth aspirated |
| Rubber band or Reusable cable tie | Either, depending on preference. | ||
| Temperature probe | Eidyer | B07J4T1VQZ | Any thermometer with at least 100 cm narrow wire probe |
References
- Wright, R. K., Cooper, E. L. Temperature effects on ectotherm immune responses. Developmental & Comparative Immunology. 5, 117-122 (1981).
- Deal, J. The temperature preferendum of certain insects. The Journal of Animal Ecology. 10 (2), 323-356 (1941).
- Hongoh, V., Berrang-Ford, L., Scott, M. E., Lindsay, L. R. Expanding geographical distribution of the mosquito, Culex pipiens, in Canada under climate change. Applied Geography. 33, 53-62 (2012).
- Beck-Johnson, L. M., et al. The importance of temperature fluctuations in understanding mosquito population dynamics and malaria risk. Royal Society Open Science. 4 (3), 160969 (2017).
- Erraguntla, M., et al. Predictive model for microclimatic temperature and its use in mosquito population modeling. Scientific Reports. 11 (1), 18909 (2021).
- Shapiro, L. L., Whitehead, S. A., Thomas, M. B. Quantifying the effects of temperature on mosquito and parasite traits that determine the transmission potential of human malaria. PLoS Biology. 15 (10), 20033489 (2017).
- Zhang, Y., et al. Decline in symbiont-dependent host detoxification metabolism contributes to increased insecticide susceptibility of insects under high temperature. The ISME Journal. 15 (12), 3693-3703 (2021).
- Amarasekare, P., Savage, V. A framework for elucidating the temperature dependence of fitness. The American Naturalist. 179 (2), 178-191 (2012).
- Buckley, L. B., Nufio, C. R. Elevational clines in the temperature dependence of insect performance and implications for ecological responses to climate change. Conservation Physiology. 2 (1), 035 (2014).
- MacLean, H. J., et al. Temperature preference across life stages and acclimation temperatures investigated in four species of Drosophila. Journal of Thermal Biology. 86, 102428 (2019).
- Castañeda, L. E., Romero-Soriano, V., Mesas, A., Roff, D. A., Santos, M. Evolutionary potential of thermal preference and heat tolerance in Drosophila subobscura. Journal of Evolutionary Biology. 32 (8), 818-824 (2019).
- Weldon, C. W., Terblanche, J. S., Bosua, H., Malod, K., Chown, S. L. Male Mediterranean fruit flies prefer warmer temperatures that improve sexual performance. Journal of Thermal Biology. 108, 103298 (2022).
- Sayeed, O., Benzer, S. Behavioral genetics of thermosensation and hygrosensation in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93 (12), 6079-6084 (1996).
- Verhulst, N. O., Brendle, A., Blanckenhorn, W. U., Mathis, A. Thermal preferences of subtropical Aedes aegypti and temperate Ae. japonicus mosquitoes. Journal of Thermal Biology. 91, 102637 (2020).
- Ziegler, R., Blanckenhorn, W. U., Mathis, A., Verhulst, N. O. Video analysis of the locomotory behaviour of Aedes aegypti and Ae. japonicus mosquitoes under different temperature regimes in a laboratory setting. Journal of Thermal Biology. 105, 103205 (2022).
- Blanford, S., Read, A. F., Thomas, M. B. Thermal behaviour of Anopheles stephensi in response to infection with malaria and fungal entomopathogens. Malaria Journal. 8, 72 (2009).
- Nakae, T. Temperature-related anomalies in the growth of selected bacteria. Journal of Dairy Science. 54 (12), 1780-1783 (1971).
- Rajpurohit, S., Schmidt, S. P. Measuring thermal behavior in smaller insects: A case study in Drosophila melanogaster demonstrates effects of sex, geographic origin, and rearing temperature on adult behavior. Fly. 10 (4), 149-161 (2016).
- Truitt, A. M., Kapun, M., Kaur, R., Miller, W. J. Wolbachia modifies thermal preference in Drosophila melanogaster. Environmental Microbiology. 21 (9), 3259-3268 (2019).
- Reinhold, J. M., et al. Species-specificity in thermopreference and CO2-gated heat-seeking in Culex mosquitoes. Insects. 13 (1), 92 (2022).
- Lin, C. S., Georghiou, G. P. Tolerance of mosquito larvae and pupae to carbon dioxide anesthesia. Mosquito News. 36 (4), 460-461 (1976).
- Ito, F., Awasaki, T. Comparative analysis of temperature preference behavior and effects of temperature on daily behavior in 11 Drosophila species. Scientific Reports. 12 (1), 1-15 (2022).
- Bartholomew, N., Burdett, J., VandenBrooks, J., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Scientific Reports. 5, 15298 (2015).
