Monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina normale e aberrante all'interno di embrioni di zebrafish intatti

Le modifiche enzimatiche guidano la metilazione attiva e la demetilazione della citosina in 5-metilcitosina (5-mC) e la successiva ossidazione di 5-mC in 5-idrossimetilcitosina, 5-formilcitosina e 5-carbossilcitosina ^1,2. Il tris(1,3-dicloro-2-propil) fosfato (TDCIPP) è un ritardante di fiamma ampiamente utilizzato negli Stati Uniti che ha precedentemente dimostrato di alterare la traiettoria della metilazione della citosina dopo l’esposizione embrionale precoce da 0,75 ore dopo la fecondazione (hpf) fino alla gastrulazione precoce (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . All’interno dei vertebrati, il 5-mC e i suoi derivati modificati sono fondamentali per regolare lo sviluppo embrionale precoce⁹. La fecondazione di un embrione innesca la demetilazione del DNA parentale, seguita dalla degradazione dell’mRNA materno, dall’attivazione del genoma zigotico e dalla rimetilazione del genoma zigotico⁹. I processi biologicamente rilevanti che utilizzano la metilazione della citosina includono la modificazione degli istoni, il reclutamento del macchinario trascrizionale, la metilazione dell’RNA, la riprogrammazione epigenetica e la determinazione della struttura della cromatina^10,11. La metilazione della citosina è conservata anche tra le specie di vertebrati, sottolineando l’importanza di comprendere e studiare come la metilazione aberrante della citosina possa influenzare la traiettoria di sviluppo di un organismo¹¹. Inoltre, lo sviluppo in utero è sensibile all’esposizione materna e ha il potenziale di causare esiti avversi come conseguenze fenotipiche immediate, effetti a lungo termine sulla suscettibilità alle malattie negli adulti ed effetti transgenerazionali dei segni epigenetici ereditari^12,13,14.

Lunghi tratti di coppie citosina-guanina, o isole CpG, sono stati i principali focolai dei ricercatori che mirano a caratterizzare la dinamica della metilazione della citosina attraverso il genoma^15,16,17. Le strategie basate sul bisolfito come il sequenziamento del bisolfito dell’intero genoma, il sequenziamento del bisolfito a rappresentazione ridotta e il sequenziamento dell’amplicone del bisolfito rappresentano il gold standard per interrogare la metilazione della citosina alla risoluzione della coppia di basi. Tuttavia, gli approcci basati sul sequenziamento sono proibitivi in termini di costi e, in quanto tali, precludono la capacità di monitorare la metilazione della citosina attraverso le fasi di sviluppo, concentrazioni multiple per sostanza chimica e replicare gli embrioni per trattamento. Inoltre, gli approcci basati sul sequenziamento non forniscono informazioni sulla localizzazione spaziale, che è fondamentale per comprendere i tipi di cellule potenzialmente interessate e le aree all’interno di un embrione in via di sviluppo. Allo stesso modo, i saggi globali di metilazione del DNA come l’analisi di restrizione dipendente dalla metilazione, i saggi immunologici legati all’enzima 5-mC (ELISA) e la cromatografia-spettrometria di massa liquida (LC-MS) 5-metil-2′-deossicitidina (5-mC) si basano su omogenati cellulari o tissutali e, come tali, precludono la capacità di monitorare la localizzazione e l’entità della metilazione della citosina nello spazio e nel tempo all’interno di campioni intatti^12,18.

A causa della facilità dell’imaging automatizzato in vivo , delle manipolazioni genetiche, del rapido tempo di sviluppo ex utero e dell’allevamento durante l’embriogenesi, gli embrioni di zebrafish continuano ad essere ampiamente utilizzati come modelli fisiologicamente intatti per scoprire percorsi mediati da xenobiotici che contribuiscono a esiti avversi durante lo sviluppo embrionale precoce. Pertanto, utilizzando anticorpi disponibili in commercio specifici per 5-mC, il protocollo seguente descrive una strategia economica per un monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina all’interno di singoli embrioni intatti di zebrafish sfruttando l’immunoistochimica a montaggio intero (IHC), l’imaging automatizzato ad alto contenuto e l’elaborazione efficiente dei dati utilizzando il linguaggio di programmazione prima dell’analisi statistica.

Secondo le conoscenze attuali, questo metodo è il primo a monitorare 5-mC all’interno di embrioni di zebrafish intatti. Il metodo consente la rilevazione della metilazione del DNA all’interno della massa cellulare e ha anche la capacità di rilevare la metilazione della citosina degli mRNA materni localizzati nel tuorlo durante la transizione da madre a zigotica. Nel complesso, questo metodo sarà utile per la rapida identificazione di sostanze chimiche che hanno il potenziale di interrompere la metilazione della citosina in situ durante la riprogrammazione epigenetica.