Monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação normal e aberrante da citosina em embriões intactos de peixe-zebra

As modificações enzimáticas conduzem à metilação ativa e à desmetilação da citosina em 5-metilcitosina (5-mC) e subsequente oxidação de 5-mC em 5-hidroximetilcitosina, 5-formilcitosina e 5-carboxilcitosina ^1,2. O fosfato de tris(1,3-dicloro-2-propil) (TDCIPP) é um retardador de chama amplamente utilizado nos Estados Unidos que já demonstrou alterar a trajetória de metilação da citosina após exposição embrionária precoce de 0,75 horas pós-fertilização (hpf) até gastrulação precoce (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . Dentro dos vertebrados, o 5-mC e seus derivados modificados são críticos para regular o desenvolvimento embrionário precoce⁹. A fertilização de um embrião desencadeia a desmetilação do DNA parental, seguida pela degradação do mRNA materno, ativação do genoma zigótico e remetilação do genoma zigótico⁹. Processos biologicamente relevantes que utilizam metilação de citosina incluem modificação de histonas, recrutamento de maquinário transcricional, metilação de RNA, reprogramação epigenética e determinação da estrutura da cromatina^10,11. A metilação da citosina também é conservada entre as espécies de vertebrados, ressaltando a importância de compreender e investigar como a metilação aberrante da citosina pode afetar a trajetória do desenvolvimento de um organismo¹¹. Além disso, o desenvolvimento in utero é sensível à exposição materna e tem o potencial de causar desfechos adversos, como consequências fenotípicas imediatas, efeitos a longo prazo na suscetibilidade à doença do adulto e efeitos transgeracionais de marcas epigenéticas hereditárias^12,13,14.

Longos trechos de pares citosina-guanina, ou ilhas CpG, têm sido os focos primários de pesquisadores que visam caracterizar a dinâmica da metilação da citosina em todo o genoma^15,16,17. Estratégias baseadas em bissulfito, como sequenciamento de bissulfito de genoma inteiro, sequenciamento de bissulfito de representação reduzida e sequenciamento de amplificador de bissulfito representam o padrão-ouro para interrogar a metilação da citosina na resolução do par de bases. No entanto, as abordagens baseadas em sequenciamento são proibitivas em termos de custo e, como tal, impedem a capacidade de monitorar a metilação da citosina em estágios de desenvolvimento, múltiplas concentrações por produto químico e replicar embriões por tratamento. Além disso, as abordagens baseadas em sequenciamento não fornecem informações sobre localização espacial, o que é crítico para a compreensão de tipos de células e áreas potencialmente afetadas dentro de um embrião em desenvolvimento. Da mesma forma, ensaios globais de metilação do DNA, como análise de restrição dependente de metilação, imunoensaios enzimáticos (ELISAs) de 5-mC e cromatografia líquida-massa (LC-MS) de 5-metil-2′-desoxicitidina (5-mC) dependem de homogeneizados celulares ou teciduais e, como tal, impedem a capacidade de monitorar a localização e a magnitude da metilação da citosina no espaço e no tempo dentro de espécimes intactos^12,18.

Devido à facilidade de imagens automatizadas in vivo , manipulações genéticas, rápido tempo de desenvolvimento ex utero e criação durante a embriogênese, os embriões de peixe-zebra continuam a ser amplamente utilizados como modelos fisiologicamente intactos para descobrir vias mediadas por xenobióticos que contribuem para resultados adversos durante o desenvolvimento embrionário inicial. Portanto, usando anticorpos comercialmente disponíveis específicos para 5 mC, o protocolo abaixo descreve uma estratégia econômica para monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação da citosina em embriões individuais e intactos de peixe-zebra, aproveitando a imuno-histoquímica (IHC) de montagem completa, imagens automatizadas de alto conteúdo e processamento de dados eficiente usando linguagem de programação antes da análise estatística.

Para o conhecimento atual, este método é o primeiro a monitorar 5-mC dentro de embriões intactos de peixe-zebra. O método permite a detecção da metilação do DNA dentro da massa celular e também tem a capacidade de detectar a metilação da citosina de mRNAs maternos localizados na gema durante a transição materna-zigótica. No geral, este método será útil para a rápida identificação de produtos químicos que têm o potencial de interromper a metilação da citosina in situ durante a reprogramação epigenética.