ניטור מרחבי-טמפורלי מהיר ויעיל של מתילציה תקינה וחריגה של ציטוזין בתוך עוברים שלמים של דגי זברה
Summary
מאמר זה מתאר פרוטוקול לניטור מהיר ויעיל של מתילציה תקינה וחריגה של ציטוזין בתוך עוברי דגי זברה שלמים.
Abstract
מתילציה של ציטוזין נשמרת מאוד בין מיני בעלי חוליות, וכגורם מפתח לתכנות אפיגנטי ולמצב הכרומטין, יש תפקיד קריטי בהתפתחות העוברית המוקדמת. שינויים אנזימטיים מניעים מתילציה פעילה ודה-מתילציה של ציטוזין ל-5-מתיל-ציטוזין (5-mC) ולאחר מכן חמצון של 5-mC ל-5-הידרוקסי-מתיל-ציטוזין, 5-פורמילציטוזין ו-5-קרבוקסילציטוזין. תכנות מחדש אפיגנטי הוא תקופה קריטית במהלך התפתחות הרחם , ולחשיפה אימהית לכימיקלים יש פוטנציאל לתכנת מחדש את האפיגנום בתוך הצאצאים. זה עלול לגרום לתוצאות שליליות כגון השלכות פנוטיפיות מיידיות, השפעות ארוכות טווח על רגישות למחלות מבוגרים והשפעות טרנס-דוריות של סימנים אפיגנטיים תורשתיים. למרות שריצוף מבוסס ביסולפיט מאפשר לחוקרים לחקור מתילציה של ציטוזין ברזולוציית זוג בסיסים, גישות מבוססות ריצוף הן בעלות גבוהה, וככאלה, מונעות את היכולת לנטר מתילציה של ציטוזין בשלבי התפתחות, ריכוזים מרובים לכל כימיקל, ולשכפל עוברים לכל טיפול. בשל הקלות של הדמיית in vivo אוטומטית, מניפולציות גנטיות, זמן התפתחות מהיר של רחם לשעבר , וגידול במהלך העוברים, עוברי דגי זברה ממשיכים לשמש כמודל שלם מבחינה פיזיולוגית לחשיפת מסלולים בתיווך קסנוביוטי התורמים לתוצאות שליליות במהלך ההתפתחות העוברית המוקדמת. לכן, תוך שימוש בנוגדנים ספציפיים ל-5 mC הזמינים מסחרית, אנו מתארים אסטרטגיה חסכונית לניטור מהיר ויעיל של מתילציה של ציטוזין בתוך עוברי דגי זברה בודדים ושלמים על ידי מינוף אימונוהיסטוכימיה שלמה, הדמיה אוטומטית בעלת תוכן גבוה ועיבוד נתונים יעיל באמצעות שפת תכנות לפני ניתוח סטטיסטי. למיטב ידיעתו, שיטה זו היא הראשונה לזהות ולכמת בהצלחה רמות של 5-mC באתרם בתוך עוברי דגי זברה במהלך ההתפתחות המוקדמת. השיטה מאפשרת זיהוי של מתילציה של דנ”א בתוך מסת התא ויש לה גם את היכולת לזהות מתילציה של ציטוזין של mRNA אימהי מקומי חלמון במהלך המעבר האימהי לזיגוטי. באופן כללי, שיטה זו תהיה שימושית לזיהוי מהיר של כימיקלים שיש להם פוטנציאל לשבש מתילציה של ציטוזין באתרה במהלך תכנות מחדש אפיגנטי.
Introduction
שינויים אנזימטיים מניעים מתילציה פעילה ודה-מתילציה של ציטוזין ל-5-מתיל-ציטוזין (5-mC) ולאחר מכן חמצון של 5-mC ל-5-הידרוקסי-מתיל-ציטוזין, 5-פורמילציטוזין ו-5-קרבוקסילציטוזין 1,2. טריס(1,3-דיכלורו-2-פרופיל) פוספט (TDCIPP) הוא מעכב בעירה בשימוש נרחב בארצות הברית שהוכח בעבר כמשנה את המסלול של מתילציה ציטוזין בעקבות חשיפה עוברית מוקדמת מ-0.75 שעות לאחר ההפריה (HPF) ועד גסטרולציה מוקדמת (6 כ”ס)3,4,5,6,7,8 . בתוך בעלי חוליות, 5-mC ונגזרותיו המתוקנות הם קריטיים לוויסות ההתפתחות העוברית המוקדמת9. הפריה של עובר גורמת לדה-מתילציה של הדנ”א ההורי, ואחריה פירוק mRNA אימהי, הפעלת הגנום הזיגוטי ומתילציה מחדש של הגנום הזיגוטי9. תהליכים רלוונטיים ביולוגית המשתמשים במתילציה של ציטוזין כוללים שינוי היסטון, גיוס מכונות שעתוק, מתילציה של RNA, תכנות מחדש אפיגנטי וקביעת מבנה הכרומטין10,11. מתילציה של ציטוזין נשמרת גם בקרב מיני בעלי חוליות, מה שמדגיש את החשיבות של הבנה וחקירה של האופן שבו מתילציה של ציטוזין סוטה עשויה להשפיע על מסלול ההתפתחות של אורגניזם11. יתר על כן, התפתחות הרחם רגישה לחשיפה אימהית ויש לה פוטנציאל לגרום לתוצאות שליליות כגון השלכות פנוטיפיות מיידיות, השפעות ארוכות טווח על רגישות למחלות מבוגרים, והשפעות טרנס-דוריות של סימנים אפיגנטיים תורשתיים12,13,14.
קטעים ארוכים של זוגות ציטוזין-גואנין, או איי CpG, היו המוקדים העיקריים של חוקרים שמטרתם לאפיין את הדינמיקה של מתילציה של ציטוזין על פני הגנום15,16,17. אסטרטגיות מבוססות ביסולפיט כגון ריצוף ביסולפיט בגנום שלם, ריצוף ביסולפיט בייצוג מופחת וריצוף אמפליקון ביסולפיט מייצגות את תקן הזהב לחקר מתילציה של ציטוזין ברזולוציית זוג בסיסים. עם זאת, גישות מבוססות ריצוף הן בעלות גבוהה, וככאלה, מונעות את היכולת לנטר מתילציה של ציטוזין בשלבי התפתחות, ריכוזים מרובים לכל כימיקל, ולשכפל עוברים לכל טיפול. בנוסף, גישות מבוססות ריצוף אינן מספקות מידע על לוקליזציה מרחבית, שהיא קריטית להבנת סוגי תאים ואזורים שעלולים להיות מושפעים בתוך עובר מתפתח. באופן דומה, מבחני מתילציה גלובליים של דנ”א, כגון ניתוח הגבלות תלויות מתילציה, בדיקות חיסוניות הקשורות לאנזים 5-mC (ELISAs), וספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית 5-מתיל-2′-דאוקסיציטידין (5-mC) (LC-MS) מסת על הומוגנאטים של תאים או רקמות, וככאלה, מונעים את היכולת לנטר את הלוקליזציה והגודל של מתילציה של ציטוזין על פני מרחב וזמן בתוך דגימות שלמות12,18.
בשל הקלות של הדמיית in vivo אוטומטית, מניפולציות גנטיות, זמן התפתחות מהיר של הרחם לשעבר , וגידול במהלך העוברים, עוברי דגי זברה ממשיכים להיות בשימוש נרחב כמודלים שלמים מבחינה פיזיולוגית כדי לחשוף מסלולים בתיווך קסנוביוטי התורמים לתוצאות שליליות במהלך ההתפתחות העוברית המוקדמת. לכן, תוך שימוש בנוגדנים זמינים מסחרית ספציפיים ל-5-mC, הפרוטוקול שלהלן מתאר אסטרטגיה חסכונית לניטור מהיר ויעיל של מתילציה של ציטוזין בתוך עוברים בודדים ושלמים של דגי זברה על ידי מינוף אימונוהיסטוכימיה שלמה (IHC), הדמיה אוטומטית בעלת תוכן גבוה ועיבוד נתונים יעיל באמצעות שפת תכנות לפני ניתוח סטטיסטי.
למיטב ידיעתו, שיטה זו היא הראשונה לניטור 5-mC בתוך עוברים שלמים של דגי זברה. השיטה מאפשרת זיהוי של מתילציה של דנ”א בתוך מסת התא ויש לה גם את היכולת לזהות מתילציה של ציטוזין של mRNA אימהי מקומי חלמון במהלך המעבר האימהי לזיגוטי. באופן כללי, שיטה זו תהיה שימושית לזיהוי מהיר של כימיקלים שיש להם פוטנציאל לשבש מתילציה של ציטוזין באתרה במהלך תכנות מחדש אפיגנטי.
Protocol
Representative Results
Discussion
במהלך פרוטוקול זה, ישנם כמה שלבים שהם קריטיים. ראשית, בעת דכוריזציה של עוברים, חשוב לכוון את המחט הרחק מהרקמה של העובר/שק החלמון/מסת התא, שכן חלקים אלה של העובר המתפתח שבריריים מאוד וקלים לניקוב. שנית, בעת העברת עוברים מסומנים לבארות בודדות, השתמש בפיפטה מזכוכית כדי להעביר עוברים מכיוון שהם …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תמיכה מחקרית ניתנה על ידי מלגת חטיבת בוגרי UCR ל- SAB, מלגת תוכנית הכשרה של NRSA T32 (T32ES018827) ל- SAB, ומענק של המכונים הלאומיים לבריאות (R01ES027576) ופרויקט האצ’ים של המכון הלאומי למזון וחקלאות של USDA (1009609) ל- DCV.
Materials
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 540225 | |
| 10-µL glass microcapillary pipette | Fisher Scientific | 211762B | |
| 100-mm plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08757100D | |
| 10x phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP399500 | |
| 1-mL pipette | Fisher Scientific | 13690032 | |
| 250-mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB501250 | |
| 5-mL pipette | Fisher Scientific | 13690033 | |
| 60-mm glass petri dishes with lids | Fisher Scientific | 08747A | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 720089 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody | Fisher Scientific | A21121 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP67110 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP2311 | |
| Hotplate | Fisher Scientific | 1110016SH | |
| In-tank breeding traps | Aquatic Habitats | N/A | This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair. Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors. |
| ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System | Molecular Devices | N/A | Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable. |
| Immunochemistry (IHC) basket | N/A | N/A | Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates. |
| MetaXpress 6.0.3.1658 | Molecular Devices | N/A | Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable. |
| Microspatula | Fisher Scientific | 2140115 | |
| Monoclonal mouse anti-5-mC antibody | Millipore Sigma | MABE146 | |
| NaOH | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 50998290 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 1337412 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 18612139 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 1368050 | |
| Rstudio | RStudio | N/A | RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com. |
| Sheep serum | Millipore Sigma | S3772-5ML | |
| Stereomicroscope | Leica | 10450103 | |
| Temperature-controlled incubator | Fisher Scientific | PR505755L | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P7949-500ML |
References
- Zhang, H. -. Y., Xiong, J., Qi, B. -. L., Feng, Y. -. Q., Yuan, B. -. F. The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals. Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).
- Huang, W., et al. Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA. Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).
- Avila-Barnard, S., et al. Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos. Environmental Research. 211, 113078 (2022).
- Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning. Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).
- Vliet, S. M. F., et al. Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).
- Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly. Environmental Science & Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).
- Dasgupta, S., et al. Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish. Environmental Science & Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).
- McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure. Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).
- Geiman, T. M., Muegge, K. DNA methylation in early development. Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).
- Wossidlo, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).
- Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. DNA methylation-mediated epigenetic control. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).
- Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).
- Ooi, S. K. T., O’Donnell, A. H., Bestor, T. H. Mammalian cytosine methylation at a glance. Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).
- Baylin, S. B., Jones, P. A. A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications. Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).
- Robertson, K. D. DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web. Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).
- Robertson, K. D. DNA methylation and human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).
- Greenberg, M. V. C., Bourc’his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
- Yuan, B. -. F., Feng, Y. -. Q. Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products. Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
