Este artículo describe un protocolo para el monitoreo espaciotemporal rápido y eficiente de la metilación de citosina normal y aberrante dentro de embriones intactos de pez cebra.
La metilación de la citosina está altamente conservada en todas las especies de vertebrados y, como impulsor clave de la programación epigenética y el estado de la cromatina, desempeña un papel crítico en el desarrollo embrionario temprano. Las modificaciones enzimáticas impulsan la metilación activa y la desmetilación de la citosina en 5-metilcitosina (5-mC) y la posterior oxidación de 5-mC en 5-hidroximetilcitosina, 5-formilcitosina y 5-carboxilcitosina. La reprogramación epigenética es un período crítico durante el desarrollo en el útero , y la exposición materna a sustancias químicas tiene el potencial de reprogramar el epigenoma dentro de la descendencia. Esto puede causar resultados adversos como consecuencias fenotípicas inmediatas, efectos a largo plazo sobre la susceptibilidad a enfermedades en adultos y efectos transgeneracionales de marcas epigenéticas hereditarias. Aunque la secuenciación basada en bisulfito permite a los investigadores interrogar la metilación de la citosina a la resolución del par de bases, los enfoques basados en la secuenciación son prohibitivos y, como tales, excluyen la capacidad de monitorear la metilación de la citosina en las etapas de desarrollo, múltiples concentraciones por sustancia química y replicar embriones por tratamiento. Debido a la facilidad de las imágenes automatizadas in vivo , las manipulaciones genéticas, el rápido tiempo de desarrollo ex utero y la cría durante la embriogénesis, los embriones de pez cebra continúan siendo utilizados como un modelo fisiológicamente intacto para descubrir vías mediadas por xenobióticos que contribuyen a resultados adversos durante el desarrollo embrionario temprano. Por lo tanto, utilizando anticuerpos específicos de 5-mC disponibles comercialmente, describimos una estrategia rentable para el monitoreo espaciotemporal rápido y eficiente de la metilación de citosina dentro de embriones individuales e intactos de pez cebra aprovechando la inmunohistoquímica de montaje completo, imágenes automatizadas de alto contenido y procesamiento eficiente de datos utilizando lenguaje de programación antes del análisis estadístico. Según el conocimiento actual, este método es el primero en detectar y cuantificar con éxito los niveles de 5 mC in situ dentro de embriones de pez cebra durante el desarrollo temprano. El método permite la detección de la metilación del ADN dentro de la masa celular y también tiene la capacidad de detectar la metilación de la citosina de los ARNm maternos localizados en la yema durante la transición materna a cigótica. En general, este método será útil para la identificación rápida de sustancias químicas que tienen el potencial de interrumpir la metilación de la citosina in situ durante la reprogramación epigenética.
Las modificaciones enzimáticas impulsan la metilación activa y la desmetilación de la citosina en 5-metilcitosina (5-mC) y la posterior oxidación de 5-mC en 5-hidroximetilcitosina, 5-formilcitosina y 5-carboxilcitosina 1,2. El fosfato de tris(1,3-dicloro-2-propil) (TDCIPP) es un retardante de llama ampliamente utilizado en los Estados Unidos que se ha demostrado previamente que altera la trayectoria de la metilación de la citosina después de la exposición embrionaria temprana desde 0,75 horas después de la fertilización (hpf) hasta la gastrulación temprana (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . Dentro de los vertebrados, el 5-mC y sus derivados modificados son críticos para regular el desarrollo embrionario temprano9. La fertilización de un embrión desencadena la desmetilación del ADN parental, seguida de la degradación del ARNm materno, la activación del genoma cigótico y la remetilación del genoma cigótico9. Los procesos biológicamente relevantes que utilizan la metilación de la citosina incluyen la modificación de histonas, el reclutamiento de maquinaria transcripcional, la metilación del ARN, la reprogramación epigenética y la determinación de la estructura de la cromatina10,11. La metilación de la citosina también se conserva entre las especies de vertebrados, lo que subraya la importancia de comprender e investigar cómo la metilación aberrante de la citosina puede afectar la trayectoria del desarrollo de un organismo11. Además, el desarrollo in utero es sensible a la exposición materna y tiene el potencial de causar resultados adversos tales como consecuencias fenotípicas inmediatas, efectos a largo plazo sobre la susceptibilidad a enfermedades adultas y efectos transgeneracionales de marcas epigenéticas hereditarias12,13,14.
Largos tramos de pares citosina-guanina, o islas CpG, han sido los focos primarios de los investigadores que tienen como objetivo caracterizar la dinámica de la metilación de la citosina a través del genoma15,16,17. Las estrategias basadas en bisulfito, como la secuenciación de bisulfito del genoma completo, la secuenciación de bisulfito de representación reducida y la secuenciación de amplicón de bisulfito, representan el estándar de oro para interrogar la metilación de citosina a resolución de pares de bases. Sin embargo, los enfoques basados en la secuenciación tienen un costo prohibitivo y, como tales, excluyen la capacidad de monitorear la metilación de la citosina en las etapas de desarrollo, múltiples concentraciones por producto químico y replicar embriones por tratamiento. Además, los enfoques basados en la secuenciación no proporcionan información sobre la localización espacial, que es fundamental para comprender los tipos de células potencialmente afectadas y las áreas dentro de un embrión en desarrollo. De manera similar, los ensayos globales de metilación del ADN, como el análisis de restricción dependiente de la metilación, los inmunoensayos ligados a enzimas (ELISA) de 5-mC y la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) de 5-metil-2′-desoxicitidina (5-mC) se basan en homogeneizados celulares o tisulares y, como tales, excluyen la capacidad de monitorear la localización y magnitud de la metilación de citosina en el espacio y el tiempo dentro de especímenes intactos12,18.
Debido a la facilidad de las imágenes automatizadas in vivo , las manipulaciones genéticas, el rápido tiempo de desarrollo ex utero y la cría durante la embriogénesis, los embriones de pez cebra continúan siendo ampliamente utilizados como modelos fisiológicamente intactos para descubrir vías mediadas por xenobióticos que contribuyen a resultados adversos durante el desarrollo embrionario temprano. Por lo tanto, utilizando anticuerpos disponibles comercialmente específicos para 5-mC, el siguiente protocolo describe una estrategia rentable para el monitoreo espaciotemporal rápido y eficiente de la metilación de la citosina dentro de embriones individuales e intactos de pez cebra aprovechando la inmunohistoquímica de montaje completo (IHC), imágenes automatizadas de alto contenido y procesamiento eficiente de datos utilizando lenguaje de programación antes del análisis estadístico.
Según el conocimiento actual, este método es el primero en monitorear 5-mC dentro de embriones intactos de pez cebra. El método permite la detección de la metilación del ADN dentro de la masa celular y también tiene la capacidad de detectar la metilación de la citosina de los ARNm maternos localizados en la yema durante la transición materna a cigótica. En general, este método será útil para la identificación rápida de sustancias químicas que tienen el potencial de interrumpir la metilación de la citosina in situ durante la reprogramación epigenética.
Durante este protocolo, hay algunos pasos que son críticos. En primer lugar, al descorionar embriones, es importante apuntar la aguja lejos del tejido del embrión / saco vitelino / masa celular, ya que estas porciones del embrión en desarrollo son muy frágiles y fáciles de perforar. En segundo lugar, al transferir embriones marcados a pocillos individuales, use una pipeta de vidrio para transferir embriones, ya que se adherirán a una pipeta de plástico. En tercer lugar, cuando realice IHC de montaje completo, aseg…
The authors have nothing to disclose.
El apoyo a la investigación fue proporcionado por una beca de la División de Graduados de la UCR a SAB, una beca del Programa de Capacitación NRSA T32 (T32ES018827) a SAB, y una subvención de los Institutos Nacionales de Salud (R01ES027576) y el Proyecto de Nacimiento del Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura (1009609) del USDA al DCV.
1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 540225 | |
10-µL glass microcapillary pipette | Fisher Scientific | 211762B | |
100-mm plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08757100D | |
10x phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP399500 | |
1-mL pipette | Fisher Scientific | 13690032 | |
250-mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB501250 | |
5-mL pipette | Fisher Scientific | 13690033 | |
60-mm glass petri dishes with lids | Fisher Scientific | 08747A | |
96-well plate | Fisher Scientific | 720089 | |
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody | Fisher Scientific | A21121 | |
Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP67110 | |
DMSO | Fisher Scientific | BP2311 | |
Hotplate | Fisher Scientific | 1110016SH | |
In-tank breeding traps | Aquatic Habitats | N/A | This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair. Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors. |
ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System | Molecular Devices | N/A | Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable. |
Immunochemistry (IHC) basket | N/A | N/A | Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates. |
MetaXpress 6.0.3.1658 | Molecular Devices | N/A | Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable. |
Microspatula | Fisher Scientific | 2140115 | |
Monoclonal mouse anti-5-mC antibody | Millipore Sigma | MABE146 | |
NaOH | Fisher Scientific | BP359-500 | |
Orbital shaker | Fisher Scientific | 50998290 | |
Parafilm | Fisher Scientific | 1337412 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 18612139 | |
Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 1368050 | |
Rstudio | RStudio | N/A | RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com. |
Sheep serum | Millipore Sigma | S3772-5ML | |
Stereomicroscope | Leica | 10450103 | |
Temperature-controlled incubator | Fisher Scientific | PR505755L | |
Tween-20 | Fisher Scientific | P7949-500ML |