Summary

Monitorización espaciotemporal rápida y eficiente de la metilación normal y aberrante de la citosina en embriones intactos de pez cebra

Published: August 18, 2022
doi:

Summary

Este artículo describe un protocolo para el monitoreo espaciotemporal rápido y eficiente de la metilación de citosina normal y aberrante dentro de embriones intactos de pez cebra.

Abstract

La metilación de la citosina está altamente conservada en todas las especies de vertebrados y, como impulsor clave de la programación epigenética y el estado de la cromatina, desempeña un papel crítico en el desarrollo embrionario temprano. Las modificaciones enzimáticas impulsan la metilación activa y la desmetilación de la citosina en 5-metilcitosina (5-mC) y la posterior oxidación de 5-mC en 5-hidroximetilcitosina, 5-formilcitosina y 5-carboxilcitosina. La reprogramación epigenética es un período crítico durante el desarrollo en el útero , y la exposición materna a sustancias químicas tiene el potencial de reprogramar el epigenoma dentro de la descendencia. Esto puede causar resultados adversos como consecuencias fenotípicas inmediatas, efectos a largo plazo sobre la susceptibilidad a enfermedades en adultos y efectos transgeneracionales de marcas epigenéticas hereditarias. Aunque la secuenciación basada en bisulfito permite a los investigadores interrogar la metilación de la citosina a la resolución del par de bases, los enfoques basados en la secuenciación son prohibitivos y, como tales, excluyen la capacidad de monitorear la metilación de la citosina en las etapas de desarrollo, múltiples concentraciones por sustancia química y replicar embriones por tratamiento. Debido a la facilidad de las imágenes automatizadas in vivo , las manipulaciones genéticas, el rápido tiempo de desarrollo ex utero y la cría durante la embriogénesis, los embriones de pez cebra continúan siendo utilizados como un modelo fisiológicamente intacto para descubrir vías mediadas por xenobióticos que contribuyen a resultados adversos durante el desarrollo embrionario temprano. Por lo tanto, utilizando anticuerpos específicos de 5-mC disponibles comercialmente, describimos una estrategia rentable para el monitoreo espaciotemporal rápido y eficiente de la metilación de citosina dentro de embriones individuales e intactos de pez cebra aprovechando la inmunohistoquímica de montaje completo, imágenes automatizadas de alto contenido y procesamiento eficiente de datos utilizando lenguaje de programación antes del análisis estadístico. Según el conocimiento actual, este método es el primero en detectar y cuantificar con éxito los niveles de 5 mC in situ dentro de embriones de pez cebra durante el desarrollo temprano. El método permite la detección de la metilación del ADN dentro de la masa celular y también tiene la capacidad de detectar la metilación de la citosina de los ARNm maternos localizados en la yema durante la transición materna a cigótica. En general, este método será útil para la identificación rápida de sustancias químicas que tienen el potencial de interrumpir la metilación de la citosina in situ durante la reprogramación epigenética.

Introduction

Las modificaciones enzimáticas impulsan la metilación activa y la desmetilación de la citosina en 5-metilcitosina (5-mC) y la posterior oxidación de 5-mC en 5-hidroximetilcitosina, 5-formilcitosina y 5-carboxilcitosina 1,2. El fosfato de tris(1,3-dicloro-2-propil) (TDCIPP) es un retardante de llama ampliamente utilizado en los Estados Unidos que se ha demostrado previamente que altera la trayectoria de la metilación de la citosina después de la exposición embrionaria temprana desde 0,75 horas después de la fertilización (hpf) hasta la gastrulación temprana (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . Dentro de los vertebrados, el 5-mC y sus derivados modificados son críticos para regular el desarrollo embrionario temprano9. La fertilización de un embrión desencadena la desmetilación del ADN parental, seguida de la degradación del ARNm materno, la activación del genoma cigótico y la remetilación del genoma cigótico9. Los procesos biológicamente relevantes que utilizan la metilación de la citosina incluyen la modificación de histonas, el reclutamiento de maquinaria transcripcional, la metilación del ARN, la reprogramación epigenética y la determinación de la estructura de la cromatina10,11. La metilación de la citosina también se conserva entre las especies de vertebrados, lo que subraya la importancia de comprender e investigar cómo la metilación aberrante de la citosina puede afectar la trayectoria del desarrollo de un organismo11. Además, el desarrollo in utero es sensible a la exposición materna y tiene el potencial de causar resultados adversos tales como consecuencias fenotípicas inmediatas, efectos a largo plazo sobre la susceptibilidad a enfermedades adultas y efectos transgeneracionales de marcas epigenéticas hereditarias12,13,14.

Largos tramos de pares citosina-guanina, o islas CpG, han sido los focos primarios de los investigadores que tienen como objetivo caracterizar la dinámica de la metilación de la citosina a través del genoma15,16,17. Las estrategias basadas en bisulfito, como la secuenciación de bisulfito del genoma completo, la secuenciación de bisulfito de representación reducida y la secuenciación de amplicón de bisulfito, representan el estándar de oro para interrogar la metilación de citosina a resolución de pares de bases. Sin embargo, los enfoques basados en la secuenciación tienen un costo prohibitivo y, como tales, excluyen la capacidad de monitorear la metilación de la citosina en las etapas de desarrollo, múltiples concentraciones por producto químico y replicar embriones por tratamiento. Además, los enfoques basados en la secuenciación no proporcionan información sobre la localización espacial, que es fundamental para comprender los tipos de células potencialmente afectadas y las áreas dentro de un embrión en desarrollo. De manera similar, los ensayos globales de metilación del ADN, como el análisis de restricción dependiente de la metilación, los inmunoensayos ligados a enzimas (ELISA) de 5-mC y la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) de 5-metil-2′-desoxicitidina (5-mC) se basan en homogeneizados celulares o tisulares y, como tales, excluyen la capacidad de monitorear la localización y magnitud de la metilación de citosina en el espacio y el tiempo dentro de especímenes intactos12,18.

Debido a la facilidad de las imágenes automatizadas in vivo , las manipulaciones genéticas, el rápido tiempo de desarrollo ex utero y la cría durante la embriogénesis, los embriones de pez cebra continúan siendo ampliamente utilizados como modelos fisiológicamente intactos para descubrir vías mediadas por xenobióticos que contribuyen a resultados adversos durante el desarrollo embrionario temprano. Por lo tanto, utilizando anticuerpos disponibles comercialmente específicos para 5-mC, el siguiente protocolo describe una estrategia rentable para el monitoreo espaciotemporal rápido y eficiente de la metilación de la citosina dentro de embriones individuales e intactos de pez cebra aprovechando la inmunohistoquímica de montaje completo (IHC), imágenes automatizadas de alto contenido y procesamiento eficiente de datos utilizando lenguaje de programación antes del análisis estadístico.

Según el conocimiento actual, este método es el primero en monitorear 5-mC dentro de embriones intactos de pez cebra. El método permite la detección de la metilación del ADN dentro de la masa celular y también tiene la capacidad de detectar la metilación de la citosina de los ARNm maternos localizados en la yema durante la transición materna a cigótica. En general, este método será útil para la identificación rápida de sustancias químicas que tienen el potencial de interrumpir la metilación de la citosina in situ durante la reprogramación epigenética.

Protocol

Los criadores adultos fueron manejados y tratados de acuerdo con un protocolo de uso de animales aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) (# 20180063) en la Universidad de California, Riverside. 1. Recolección de embriones de pez cebra y exposición química Agregue trampas de reproducción en el tanque a los tanques que contengan peces cebra machos y hembras adultos sexualmente maduros y reproductivamente viables. Agregue al menos …

Representative Results

El objetivo general de este protocolo es determinar si un tratamiento afecta la abundancia relativa de 5 mC mediante la evaluación del área total y la intensidad relativa de la fluorescencia dentro de embriones fijos y marcados de pez cebra. Después de completar el protocolo, se puede usar un microscopio estereoscópico de fluorescencia para determinar primero si la IHC de montaje completo fue exitosa. Cuando los embriones marcados se observan bajo un filtro FITC o GFP, un resultado positivo se indica mediante una se?…

Discussion

Durante este protocolo, hay algunos pasos que son críticos. En primer lugar, al descorionar embriones, es importante apuntar la aguja lejos del tejido del embrión / saco vitelino / masa celular, ya que estas porciones del embrión en desarrollo son muy frágiles y fáciles de perforar. En segundo lugar, al transferir embriones marcados a pocillos individuales, use una pipeta de vidrio para transferir embriones, ya que se adherirán a una pipeta de plástico. En tercer lugar, cuando realice IHC de montaje completo, aseg…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El apoyo a la investigación fue proporcionado por una beca de la División de Graduados de la UCR a SAB, una beca del Programa de Capacitación NRSA T32 (T32ES018827) a SAB, y una subvención de los Institutos Nacionales de Salud (R01ES027576) y el Proyecto de Nacimiento del Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura (1009609) del USDA al DCV.

Materials

1.5-mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 540225
10-µL glass microcapillary pipette Fisher Scientific 211762B
100-mm plastic Petri dish Fisher Scientific 08757100D
10x phosphate-buffered saline  Fisher Scientific BP399500
1-mL pipette  Fisher Scientific 13690032
250-mL Erlenmeyer flask Fisher Scientific FB501250
5-mL pipette Fisher Scientific 13690033
60-mm glass petri dishes with lids Fisher Scientific 08747A
96-well plate Fisher Scientific 720089
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody  Fisher Scientific A21121
Bovine serum albumin Fisher Scientific BP67110
DMSO Fisher Scientific BP2311
Hotplate  Fisher Scientific 1110016SH
In-tank breeding traps Aquatic Habitats N/A This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.  Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.
ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System Molecular Devices N/A Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.
Immunochemistry (IHC) basket N/A N/A Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.
MetaXpress 6.0.3.1658  Molecular Devices N/A Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.
Microspatula Fisher Scientific 2140115
Monoclonal mouse anti-5-mC antibody Millipore Sigma MABE146
NaOH Fisher Scientific BP359-500
Orbital shaker  Fisher Scientific 50998290
Parafilm  Fisher Scientific 1337412
Paraformaldehyde  Fisher Scientific 18612139
Plastic transfer pipette Fisher Scientific 1368050
Rstudio RStudio N/A RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.
Sheep serum Millipore Sigma S3772-5ML
Stereomicroscope Leica 10450103
Temperature-controlled incubator  Fisher Scientific PR505755L
Tween-20  Fisher Scientific P7949-500ML

References

  1. Zhang, H. -. Y., Xiong, J., Qi, B. -. L., Feng, Y. -. Q., Yuan, B. -. F. The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals. Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).
  2. Huang, W., et al. Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA. Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).
  3. Avila-Barnard, S., et al. Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos. Environmental Research. 211, 113078 (2022).
  4. Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning. Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).
  5. Vliet, S. M. F., et al. Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).
  6. Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly. Environmental Science & Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).
  7. Dasgupta, S., et al. Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish. Environmental Science & Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).
  8. McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure. Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).
  9. Geiman, T. M., Muegge, K. DNA methylation in early development. Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).
  10. Wossidlo, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).
  11. Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. DNA methylation-mediated epigenetic control. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).
  12. Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).
  13. Ooi, S. K. T., O’Donnell, A. H., Bestor, T. H. Mammalian cytosine methylation at a glance. Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).
  14. Baylin, S. B., Jones, P. A. A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications. Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).
  15. Robertson, K. D. DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web. Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).
  16. Robertson, K. D. DNA methylation and human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).
  17. Greenberg, M. V. C., Bourc’his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
  18. Yuan, B. -. F., Feng, Y. -. Q. Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products. Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).
  19. Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).

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Avila-Barnard, S., Volz, D. C. Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (186), e64190, doi:10.3791/64190 (2022).

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