Schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der normalen und aberranten Cytosinmethylierung in intakten Zebrafischembryonen

Enzymatische Modifikationen treiben die aktive Methylierung und Demethylierung von Cytosin zu 5-Methylcytosin (5-mC) und die anschließende Oxidation von 5-mC zu 5-Hydroxymethylcytosin, 5-Formylcytosin und 5-Carboxylcytosin ^1,2 voran. Tris(1,3-dichlor-2-propyl) phosphat (TDCIPP) ist ein in den Vereinigten Staaten weit verbreitetes Flammschutzmittel, von dem zuvor gezeigt wurde, dass es den Verlauf der Cytosinmethylierung nach früher embryonaler Exposition von 0,75 Stunden nach der Befruchtung (hpf) bis zur frühen Gastrulation (6 hpf⁾ verändert3,4,5,6,7,8 . Bei Wirbeltieren sind 5-mC und seine modifizierten Derivate entscheidend für die Regulierung der frühen Embryonalentwicklung⁹. Die Befruchtung eines Embryos löst die Demethylierung der elterlichen DNA aus, gefolgt vom mütterlichen mRNA-Abbau, der Aktivierung des zygotischen Genoms und der Remethylierung des zygotischen Genoms⁹. Zu den biologisch relevanten Prozessen, die die Cytosinmethylierung nutzen, gehören die Histonmodifikation, die Rekrutierung von Transkriptionsmaschinen, die RNA-Methylierung, die epigenetische Reprogrammierung und die Bestimmung der Chromatinstruktur^10,11. Die Cytosinmethylierung ist auch bei Wirbeltierarten konserviert, was unterstreicht, wie wichtig es ist, zu verstehen und zu untersuchen, wie aberrante Cytosinmethylierung den Entwicklungsverlauf eines Organismus beeinflussen kann¹¹. Darüber hinaus reagiert die Entwicklung in utero empfindlich auf mütterliche Exposition und hat das Potenzial, nachteilige Ergebnisse wie unmittelbare phänotypische Folgen, langfristige Auswirkungen auf die Krankheitsanfälligkeit bei Erwachsenen und transgenerationale Effekte von vererbten epigenetischen Markierungen zu verursachen^12,13,14.

Lange Strecken von Cytosin-Guanin-Paaren oder CpG-Inseln waren die primären Schwerpunkte von Forschern, die darauf abzielen, die Dynamik der Cytosinmethylierung über das Genom 15,16,17 zu charakterisieren. Bisulfit-basierte Strategien wie die Bisulfitsequenzierung des gesamten Genoms, die Bisulfitsequenzierung mit reduzierter Repräsentation und die Bisulfitamplikonsequenzierung stellen den Goldstandard für die Abfrage der Cytosinmethylierung bei Basenpaarauflösung dar. Sequenzierungsbasierte Ansätze sind jedoch unerschwinglich und schließen daher die Möglichkeit aus, die Cytosinmethylierung über Entwicklungsstadien, mehrere Konzentrationen pro Chemikalie und Replikation von Embryonen pro Behandlung hinweg zu überwachen. Darüber hinaus liefern sequenzierungsbasierte Ansätze keine Informationen über die räumliche Lokalisation, die für das Verständnis potenziell betroffener Zelltypen und -bereiche innerhalb eines sich entwickelnden Embryos entscheidend ist. In ähnlicher Weise beruhen globale DNA-Methylierungsassays wie die methylierungsabhängige Restriktionsanalyse, 5-mC-Enzym-verknüpfte Immunoassays (ELISAs) und die 5-Methyl-2′-Desoxycytidin-(5-mC)-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) auf Zell- oder Gewebehomogenaten und schließen daher die Fähigkeit aus, die Lokalisation und das Ausmaß der Cytosinmethylierung über Raum und Zeit innerhalb intakter Proben zu überwachen^12,18.

Aufgrund der einfachen automatisierten In-vivo-Bildgebung , genetischer Manipulationen, schneller Ex-utero-Entwicklungszeit und Haltung während der Embryogenese werden Zebrafischembryonen weiterhin häufig als physiologisch intakte Modelle verwendet, um xenobiotisch vermittelte Signalwege aufzudecken, die zu nachteiligen Ergebnissen während der frühen Embryonalentwicklung beitragen. Daher beschreibt das folgende Protokoll unter Verwendung kommerziell verfügbarer Antikörper, die spezifisch für 5-mC sind, eine kostengünstige Strategie für die schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der Cytosinmethylierung in einzelnen, intakten Zebrafischembryonen durch Nutzung der gesamten Immunhistochemie (IHC), automatisierter High-Content-Bildgebung und effizienter Datenverarbeitung unter Verwendung der Programmiersprache vor der statistischen Analyse.

Nach heutigem Kenntnisstand ist diese Methode die erste, die 5-mC in intakten Zebrafischembryonen überwacht. Die Methode ermöglicht den Nachweis von DNA-Methylierung innerhalb der Zellmasse und hat auch die Fähigkeit, Cytosin-Methylierung von Eigelb-lokalisierten mütterlichen mRNAs während des mütterlichen zu zygotischen Übergangs nachzuweisen. Insgesamt wird diese Methode für die schnelle Identifizierung von Chemikalien nützlich sein, die das Potenzial haben, die Cytosinmethylierung in situ während der epigenetischen Reprogrammierung zu stören.