無傷ゼブラフィッシュ胚における正常および異常なシトシンメチル化の迅速かつ効率的な時空間モニタリング

酵素修飾は、シトシンの5-メチルシトシン(5-mC)への活性メチル化および脱メチル化、およびそれに続く5-mCの5-ヒドロキシメチルシトシン、5-ホルミルシトシン、および5-カルボキシルシトシンへの酸化を促進します^1,2。リン酸トリス(1,3-ジクロロ-2-プロピル)(TDCIPP)は、米国で広く使用されている難燃剤であり、受精後0.75時間(hpf)から早期原腸形成(6hpf)までの初期胚曝露後のシトシンメチル化の軌跡を変化させることが以前に実証されています3,4,5,6,7,8。.脊椎動物の中では、5-mCとその修飾誘導体は初期胚発生を調節するために重要です⁹。胚の受精は、親DNAの脱メチル化を引き起こし、続いて母体のmRNA分解、接合子ゲノムの活性化、および接合子ゲノムの再メチル化を引き起こします⁹。シトシンメチル化を利用する生物学的に関連するプロセスには、ヒストン修飾、転写機構の動員、RNAメチル化、エピジェネティックなリプログラミング、およびクロマチン構造の決定が含まれます^10,11。シトシンメチル化は脊椎動物種の間でも保存されており、異常なシトシンメチル化が生物の発生の軌跡にどのように影響するかを理解し、調査することの重要性を強調しています¹¹。さらに、子宮内での発達は母親の曝露に敏感であり、即時の表現型の結果、成人病の感受性に対する長期的な影響、および遺伝性のエピジェネティックマークの世代を超えた影響などの有害な結果を引き起こす可能性があります^12,13,14。

長いシトシン-グアニンペア、またはCpGアイランドは、ゲノム全体のシトシンメチル化のダイナミクスを特徴付けることを目的とした研究者の主要な病巣でした^15,16,17。全ゲノムバイサルファイトシーケンシング、還元表現バイサルファイトシーケンシング、バイサルファイトアンプリコンシーケンシングなどのバイサルファイトベースの戦略は、塩基対分解能でシトシンメチル化を調べるためのゴールドスタンダードです。ただし、シーケンシングベースのアプローチはコストがかかりすぎるため、発生段階全体でシトシンメチル化を監視し、化学物質ごとに複数の濃度を監視し、処理ごとに胚を複製する機能がありません。さらに、シーケンシングベースのアプローチでは、影響を受ける可能性のある細胞タイプや発生中の胚内の領域を理解するために重要な空間局在に関する情報は提供されません。同様に、メチル化依存性制限分析、5-mC酵素結合イムノアッセイ(ELISA)、5-メチル-2′-デオキシシチジン(5-mC)液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)などのグローバルDNAメチル化アッセイは、細胞または組織のホモジネートに依存しているため、無傷の標本内の空間および時間にわたるシトシンメチル化の局在と大きさをモニターする能力が妨げられています^12,18。

自動化された in vivo イメージング、遺伝子操作、子宮 外 発生時間の迅速化、および胚発生中の飼育の容易さにより、ゼブラフィッシュ胚は、初期胚発生中の有害な結果に寄与する生体異物媒介経路を明らかにするための生理学的に無傷のモデルとして引き続き広く使用されています。したがって、以下のプロトコルでは、5-mCに特異的な市販の抗体を使用して、ホールマウント免疫組織化学(IHC)、自動化されたハイコンテントイメージング、および統計分析前のプログラミング言語を使用した効率的なデータ処理を活用して、個々の無傷のゼブラフィッシュ胚内のシトシンメチル化を迅速かつ効率的に時空間的にモニタリングするための費用効果の高い戦略について説明します。

現在の知る限り、この方法は、無傷のゼブラフィッシュ胚内の5-mCを監視する最初の方法です。この方法は、細胞塊内のDNAメチル化の検出を可能にし、母体から接合体への移行中に卵黄に局在する母体mRNAのシトシンメチル化を検出する能力も有する。全体として、この方法は、エピジェネティックなリプログラミング中にシトシンメチル化を in situ で破壊する可能性のある化学物質の迅速な同定に役立ちます。