Summary

Snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie binnen intacte zebravisembryo's

Published: August 18, 2022
doi:

Summary

Dit artikel beschrijft een protocol voor de snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie in intacte zebravisembryo’s.

Abstract

Cytosinemethylatie is sterk geconserveerd bij gewervelde soorten en speelt, als een belangrijke aanjager van epigenetische programmering en chromatinetoestand, een cruciale rol in de vroege embryonale ontwikkeling. Enzymatische modificaties stimuleren actieve methylering en demethylering van cytosine in 5-methylcytosine (5-mC) en daaropvolgende oxidatie van 5-mC in 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine en 5-carboxylcytosine. Epigenetische herprogrammering is een kritieke periode tijdens de ontwikkeling van de baarmoeder en maternale blootstelling aan chemicaliën heeft het potentieel om het epigenoom in nakomelingen te herprogrammeren. Dit kan mogelijk nadelige gevolgen veroorzaken, zoals onmiddellijke fenotypische gevolgen, langetermijneffecten op de gevoeligheid voor volwassen ziekten en transgenerationele effecten van erfelijke epigenetische kenmerken. Hoewel op bisulfiet gebaseerde sequencing onderzoekers in staat stelt om cytosinemethylatie met basenpaarresolutie te ondervragen, zijn op sequencing gebaseerde benaderingen onbetaalbaar en sluiten ze als zodanig de mogelijkheid uit om cytosinemethylatie in ontwikkelingsstadia, meerdere concentraties per chemische stof te controleren en embryo’s per behandeling te repliceren. Vanwege het gemak van geautomatiseerde in vivo beeldvorming, genetische manipulaties, snelle ex-utero-ontwikkelingstijd en houderij tijdens embryogenese, blijven zebravisembryo’s worden gebruikt als een fysiologisch intact model voor het blootleggen van xenobiotisch gemedieerde routes die bijdragen aan nadelige resultaten tijdens de vroege embryonale ontwikkeling. Daarom beschrijven we, met behulp van commercieel beschikbare 5-mC-specifieke antilichamen, een kosteneffectieve strategie voor snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van cytosinemethylatie binnen individuele, intacte zebravisembryo’s door gebruik te maken van immunohistochemie met hele mount, geautomatiseerde beeldvorming met hoge inhoud en efficiënte gegevensverwerking met behulp van programmeertaal voorafgaand aan statistische analyse. Volgens de huidige kennis is deze methode de eerste die met succes 5-mC-niveaus in situ in zebravisembryo’s detecteert en kwantificeert tijdens de vroege ontwikkeling. De methode maakt de detectie van DNA-methylatie in de celmassa mogelijk en heeft ook de mogelijkheid om cytosinemethylatie van dooier-gelokaliseerde maternale mRNA’s te detecteren tijdens de maternale naar zygote overgang. Over het algemeen zal deze methode nuttig zijn voor de snelle identificatie van chemische stoffen die het potentieel hebben om cytosinemethylatie in situ te verstoren tijdens epigenetische herprogrammering.

Introduction

Enzymatische modificaties stimuleren actieve methylering en demethylering van cytosine in 5-methylcytosine (5-mC) en daaropvolgende oxidatie van 5-mC in 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine en 5-carboxylcytosine 1,2. Tris(1,3-dichloor-2-propyl)fosfaat (TDCIPP) is een veelgebruikte vlamvertrager in de Verenigde Staten waarvan eerder is aangetoond dat het het traject van cytosinemethylatie verandert na vroege embryonale blootstelling vanaf 0,75 uur na de bevruchting (hpf) door vroege gastrulatie (6 pkf)3,4,5,6,7,8 . Binnen gewervelde dieren zijn 5-mC en zijn gemodificeerde derivaten van cruciaal belang voor het reguleren van de vroege embryonale ontwikkeling9. Bevruchting van een embryo veroorzaakt demethylatie van ouderlijk DNA, gevolgd door maternale mRNA-afbraak, zygotische genoomactivering en remethylering van het zygotische genoom9. Biologisch relevante processen die cytosinemethylatie gebruiken, omvatten histonmodificatie, rekrutering van transcriptionele machines, RNA-methylatie, epigenetische herprogrammering en bepaling van chromatinestructuur10,11. Cytosinemethylatie wordt ook bewaard bij gewervelde soorten, wat het belang onderstreept van het begrijpen en onderzoeken van hoe afwijkende cytosinemethylatie het traject van de ontwikkeling van een organisme kan beïnvloeden11. Bovendien is de ontwikkeling in utero gevoelig voor maternale blootstelling en kan het nadelige uitkomsten veroorzaken, zoals onmiddellijke fenotypische gevolgen, langetermijneffecten op de gevoeligheid voor volwassen ziekten en transgenerationele effecten van erfelijke epigenetische kenmerken 12,13,14.

Lange stukken cytosine-guanineparen, of CpG-eilanden, zijn de primaire foci van onderzoekers geweest die tot doel hebben de dynamiek van cytosinemethylatie in het genoom te karakteriseren 15,16,17. Op bisulfiet gebaseerde strategieën zoals bisulfietsequencing van het hele genoom, bisulfietsequencing met verminderde representatie en bisulfiet ampliconsequencing vertegenwoordigen de gouden standaard voor het ondervragen van cytosinemethylatie bij basenpaarresolutie. Op sequencing gebaseerde benaderingen zijn echter onbetaalbaar en sluiten als zodanig de mogelijkheid uit om cytosinemethylatie in ontwikkelingsstadia, meerdere concentraties per chemische stof te controleren en embryo’s per behandeling te repliceren. Bovendien bieden op sequencing gebaseerde benaderingen geen informatie over ruimtelijke lokalisatie, wat van cruciaal belang is voor het begrijpen van mogelijk aangetaste celtypen en gebieden binnen een zich ontwikkelend embryo. Evenzo vertrouwen globale DNA-methylatietests zoals methylatieafhankelijke restrictieanalyse, 5-mC enzymgebonden immunoassays (ELISA’s) en 5-methyl-2′-deoxycytidine (5-mC) vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) op cel- of weefselhomogenaten en sluiten als zodanig de mogelijkheid uit om de lokalisatie en omvang van cytosinemethylatie over ruimte en tijd in intacte monsters te controleren12,18.

Vanwege het gemak van geautomatiseerde in vivo beeldvorming, genetische manipulaties, snelle ex-utero-ontwikkelingstijd en houderij tijdens embryogenese, worden zebravisembryo’s nog steeds op grote schaal gebruikt als fysiologisch intacte modellen om xenobiotisch gemedieerde routes te ontdekken die bijdragen aan nadelige resultaten tijdens de vroege embryonale ontwikkeling. Daarom beschrijft het onderstaande protocol, met behulp van commercieel beschikbare antilichamen die specifiek zijn voor 5-mC, een kosteneffectieve strategie voor snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van cytosinemethylatie in individuele, intacte zebravisembryo’s door gebruik te maken van whole-mount immunohistochemie (IHC), geautomatiseerde beeldvorming met hoge inhoud en efficiënte gegevensverwerking met behulp van programmeertaal voorafgaand aan statistische analyse.

Voor zover bekend is deze methode de eerste die 5-mC monitort binnen intacte zebravisembryo’s. De methode maakt de detectie van DNA-methylatie in de celmassa mogelijk en heeft ook de mogelijkheid om cytosinemethylatie van dooier-gelokaliseerde maternale mRNA’s te detecteren tijdens de maternale naar zygote overgang. Over het algemeen zal deze methode nuttig zijn voor de snelle identificatie van chemische stoffen die het potentieel hebben om cytosinemethylatie in situ te verstoren tijdens epigenetische herprogrammering.

Protocol

Volwassen fokkers werden behandeld en behandeld in overeenstemming met een door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) goedgekeurd protocol voor diergebruik (# 20180063) aan de Universiteit van Californië, Riverside. 1. Embryoverzameling van zebravis en blootstelling aan chemische stoffen Voeg kweekvallen in de tank toe aan tanks met geslachtsrijpe en reproductief levensvatbare volwassen mannelijke en vrouwelijke zebravissen. Voeg ten minste drie va…

Representative Results

Het algemene doel van dit protocol is om te bepalen of een behandeling de relatieve abundantie van 5-mC beïnvloedt door het totale gebied en de relatieve intensiteit van fluorescentie binnen vaste en gelabelde zebravisembryo’s te beoordelen. Na het voltooien van het protocol kan een fluorescentiemicroscoop worden gebruikt om eerst te bepalen of de IHC met hele mount succesvol was. Wanneer gelabelde embryo’s worden waargenomen onder een FITC- of GFP-filter, wordt een positief resultaat aangegeven door een positief FITC-s…

Discussion

Tijdens dit protocol zijn er een paar stappen die van cruciaal belang zijn. Ten eerste is het bij het dechorioneren van embryo’s belangrijk om de naald weg te wijzen van het weefsel van de embryo/ dooierzak / celmassa, omdat deze delen van het zich ontwikkelende embryo zeer kwetsbaar en gemakkelijk te doorboren zijn. Ten tweede, bij het overbrengen van gelabelde embryo’s naar individuele putten, gebruik dan een glazen pipet om embryo’s over te brengen, omdat ze zich hechten aan een plastic pipet. Ten derde, bij het uitvo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Onderzoeksondersteuning werd geleverd door een UCR Graduate Division Fellowship aan SAB, een NRSA T32 Training Program Fellowship (T32ES018827) aan SAB en een National Institutes of Health-beurs (R01ES027576) en USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) aan DCV.

Materials

1.5-mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 540225
10-µL glass microcapillary pipette Fisher Scientific 211762B
100-mm plastic Petri dish Fisher Scientific 08757100D
10x phosphate-buffered saline  Fisher Scientific BP399500
1-mL pipette  Fisher Scientific 13690032
250-mL Erlenmeyer flask Fisher Scientific FB501250
5-mL pipette Fisher Scientific 13690033
60-mm glass petri dishes with lids Fisher Scientific 08747A
96-well plate Fisher Scientific 720089
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody  Fisher Scientific A21121
Bovine serum albumin Fisher Scientific BP67110
DMSO Fisher Scientific BP2311
Hotplate  Fisher Scientific 1110016SH
In-tank breeding traps Aquatic Habitats N/A This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.  Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.
ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System Molecular Devices N/A Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.
Immunochemistry (IHC) basket N/A N/A Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.
MetaXpress 6.0.3.1658  Molecular Devices N/A Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.
Microspatula Fisher Scientific 2140115
Monoclonal mouse anti-5-mC antibody Millipore Sigma MABE146
NaOH Fisher Scientific BP359-500
Orbital shaker  Fisher Scientific 50998290
Parafilm  Fisher Scientific 1337412
Paraformaldehyde  Fisher Scientific 18612139
Plastic transfer pipette Fisher Scientific 1368050
Rstudio RStudio N/A RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.
Sheep serum Millipore Sigma S3772-5ML
Stereomicroscope Leica 10450103
Temperature-controlled incubator  Fisher Scientific PR505755L
Tween-20  Fisher Scientific P7949-500ML

References

  1. Zhang, H. -. Y., Xiong, J., Qi, B. -. L., Feng, Y. -. Q., Yuan, B. -. F. The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals. Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).
  2. Huang, W., et al. Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA. Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).
  3. Avila-Barnard, S., et al. Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos. Environmental Research. 211, 113078 (2022).
  4. Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning. Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).
  5. Vliet, S. M. F., et al. Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).
  6. Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly. Environmental Science & Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).
  7. Dasgupta, S., et al. Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish. Environmental Science & Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).
  8. McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure. Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).
  9. Geiman, T. M., Muegge, K. DNA methylation in early development. Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).
  10. Wossidlo, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).
  11. Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. DNA methylation-mediated epigenetic control. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).
  12. Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).
  13. Ooi, S. K. T., O’Donnell, A. H., Bestor, T. H. Mammalian cytosine methylation at a glance. Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).
  14. Baylin, S. B., Jones, P. A. A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications. Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).
  15. Robertson, K. D. DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web. Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).
  16. Robertson, K. D. DNA methylation and human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).
  17. Greenberg, M. V. C., Bourc’his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
  18. Yuan, B. -. F., Feng, Y. -. Q. Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products. Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).
  19. Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).

Play Video

Cite This Article
Avila-Barnard, S., Volz, D. C. Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (186), e64190, doi:10.3791/64190 (2022).

View Video