Summary

المراقبة الزمانية المكانية السريعة والفعالة لمثيلة السيتوزين الطبيعية والشاذة داخل أجنة الزرد السليمة

Published: August 18, 2022
doi:

Summary

تصف هذه الورقة بروتوكولا للمراقبة الزمانية المكانية السريعة والفعالة لمثيلة السيتوزين الطبيعية والشاذة داخل أجنة الزرد السليمة.

Abstract

يتم الحفاظ على مثيلة السيتوزين بشكل كبير عبر أنواع الفقاريات ، وكمحرك رئيسي للبرمجة اللاجينية وحالة الكروماتين ، تلعب دورا مهما في التطور الجنيني المبكر. تؤدي التعديلات الأنزيمية إلى المثيلة النشطة وإزالة ميثيل السيتوزين إلى 5-ميثيل سيتوزين (5-mC) والأكسدة اللاحقة ل 5-mC إلى 5-hydroxymethylcytosine و 5-formylcytosine و 5-carboxylcytosine. إعادة البرمجة اللاجينية هي فترة حرجة أثناء تطور الرحم ، وتعرض الأمهات للمواد الكيميائية لديه القدرة على إعادة برمجة epigenome داخل النسل. يمكن أن يتسبب هذا في نتائج سلبية مثل عواقب النمط الظاهري الفوري ، والآثار طويلة المدى على قابلية الإصابة بأمراض البالغين ، والآثار عبر الأجيال للعلامات اللاجينية الموروثة. على الرغم من أن التسلسل القائم على ثنائي الكبريتيت يمكن الباحثين من استجواب مثيلة السيتوزين بدقة زوج القاعدة ، فإن النهج القائمة على التسلسل باهظة التكلفة ، وعلى هذا النحو ، تمنع القدرة على مراقبة مثيلة السيتوزين عبر مراحل النمو ، وتركيزات متعددة لكل مادة كيميائية ، وتكرار الأجنة لكل علاج. نظرا لسهولة التصوير الآلي في الجسم الحي ، والتلاعب الجيني ، ووقت التطور السريع خارج الرحم ، والتربية أثناء التطور الجنيني ، يستمر استخدام أجنة الزرد كنموذج سليم من الناحية الفسيولوجية للكشف عن المسارات بوساطة الأجانب التي تساهم في النتائج السلبية أثناء التطور الجنيني المبكر. لذلك ، باستخدام الأجسام المضادة الخاصة ب 5 mC المتاحة تجاريا ، نصف استراتيجية فعالة من حيث التكلفة للمراقبة الزمانية المكانية السريعة والفعالة لمثيلة السيتوزين داخل أجنة الزرد الفردية السليمة من خلال الاستفادة من الكيمياء الهيستولوجية المناعية الكاملة ، والتصوير الآلي عالي المحتوى ، ومعالجة البيانات الفعالة باستخدام لغة البرمجة قبل التحليل الإحصائي. وفقا للمعرفة الحالية ، هذه الطريقة هي الأولى التي نجحت في اكتشاف وتحديد مستويات 5 mC في الموقع داخل أجنة الزرد أثناء التطور المبكر. تتيح هذه الطريقة الكشف عن مثيلة الحمض النووي داخل كتلة الخلية ولديها أيضا القدرة على اكتشاف مثيلة السيتوزين ل mRNAs الأم الموضعية بالصفار أثناء الانتقال من الأم إلى الزيجوت. بشكل عام ، ستكون هذه الطريقة مفيدة في التعرف السريع على المواد الكيميائية التي لديها القدرة على تعطيل مثيلة السيتوزين في الموقع أثناء إعادة البرمجة اللاجينية.

Introduction

تؤدي التعديلات الأنزيمية إلى المثيلة النشطة وإزالة ميثيل السيتوزين إلى 5-ميثيل سيتوزين (5-mC) والأكسدة اللاحقة ل 5-mC إلى 5-hydroxymethylcytosine و 5-formylcytosine و 5-carboxylcytosine 1,2. Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate (TDCIPP) هو مثبط للهب يستخدم على نطاق واسع في الولايات المتحدة وقد ثبت سابقا أنه يغير مسار مثيلة السيتوزين بعد التعرض الجنيني المبكر من 0.75 ساعة بعد الإخصاب (HPF) من خلال المعدة المبكرة (6 HPF) 3،4،5،6،7،8 . داخل الفقاريات ، تعتبر 5-mC ومشتقاتها المعدلة ضرورية لتنظيم التطور الجنيني المبكر9. يؤدي إخصاب الجنين إلى إزالة ميثيل الحمض النووي الأبوي ، يليه تدهور mRNA الأمومي ، وتنشيط الجينوم الزيجوتي ، وإعادة مثيلة الجينومالزيجوتي 9. تشمل العمليات ذات الصلة بيولوجيا التي تستخدم مثيلة السيتوزين تعديل الهستون ، وتوظيف آلات النسخ ، ومثيلة الحمض النووي الريبي ، وإعادة البرمجة اللاجينية ، وتحديد بنية الكروماتين10,11. يتم الحفاظ على مثيلة السيتوزين أيضا بين أنواع الفقاريات ، مما يؤكد أهمية فهم والتحقيق في كيفية تأثير مثيلة السيتوزين الشاذة على مسار تطور الكائن الحي11. علاوة على ذلك ، فإن التطور في الرحم حساس لتعرض الأمهات ولديه القدرة على التسبب في نتائج سلبية مثل العواقب المظهرية الفورية ، والآثار طويلة المدى على قابلية البالغين للأمراض ، والآثار عبر الأجيال للعلامات اللاجينية الموروثة12،13،14.

كانت الامتدادات الطويلة لأزواج السيتوزين والجوانين ، أو جزر CpG ، هي البؤر الأساسية للباحثين الذين يهدفون إلى توصيف ديناميكيات مثيلة السيتوزين عبر الجينوم15،16،17. تمثل الاستراتيجيات القائمة على ثنائي الكبريتيت مثل تسلسل ثنائي كبريتيت الجينوم الكامل ، وتسلسل ثنائي الكبريتيت منخفض التمثيل ، وتسلسل أمبليكون ثنائي الكبريتيت المعيار الذهبي لاستجواب مثيلة السيتوزين بدقة زوج القاعدة. ومع ذلك ، فإن النهج القائمة على التسلسل باهظة التكلفة ، وبالتالي ، تمنع القدرة على مراقبة مثيلة السيتوزين عبر مراحل النمو ، والتركيزات المتعددة لكل مادة كيميائية ، وتكرار الأجنة لكل علاج. بالإضافة إلى ذلك ، لا توفر الأساليب القائمة على التسلسل معلومات حول التوطين المكاني ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم أنواع الخلايا والمناطق التي يحتمل أن تتأثر داخل الجنين النامي. وبالمثل ، فإن مقايسات مثيلة الحمض النووي العالمية مثل تحليل التقييد المعتمد على المثيلة ، والمقايسات المناعية المرتبطة بالإنزيم 5-mC (ELISAs) ، و 5-methyl-2′-deoxycytidine (5-mC) قياس الطيف الكتلي اللوني السائل (LC-MS) تعتمد على تجانس الخلايا أو الأنسجة ، وعلى هذا النحو ، تمنع القدرة على مراقبة توطين وحجم مثيلة السيتوزين عبر المكان والزمان داخل العينات السليمة12,18.

نظرا لسهولة التصوير الآلي في الجسم الحي ، والتلاعب الجيني ، ووقت التطور السريع خارج الرحم ، والتربية أثناء التطور الجنيني ، لا تزال أجنة الزرد تستخدم على نطاق واسع كنماذج سليمة من الناحية الفسيولوجية للكشف عن المسارات بوساطة الأجانب التي تساهم في النتائج السلبية أثناء التطور الجنيني المبكر. لذلك ، باستخدام الأجسام المضادة المتاحة تجاريا الخاصة ب 5-mC ، يصف البروتوكول أدناه استراتيجية فعالة من حيث التكلفة للمراقبة الزمانية المكانية السريعة والفعالة لمثيلة السيتوزين داخل أجنة الزرد الفردية السليمة من خلال الاستفادة من الكيمياء الهيستولوجية المناعية الكاملة (IHC) ، والتصوير الآلي عالي المحتوى ، ومعالجة البيانات بكفاءة باستخدام لغة البرمجة قبل التحليل الإحصائي.

للمعرفة الحالية ، هذه الطريقة هي الأولى لمراقبة 5 mC داخل أجنة الزرد سليمة. تتيح هذه الطريقة الكشف عن مثيلة الحمض النووي داخل كتلة الخلية ولديها أيضا القدرة على اكتشاف مثيلة السيتوزين ل mRNAs الأم الموضعية بالصفار أثناء الانتقال من الأم إلى الزيجوت. بشكل عام ، ستكون هذه الطريقة مفيدة في التعرف السريع على المواد الكيميائية التي لديها القدرة على تعطيل مثيلة السيتوزين في الموقع أثناء إعادة البرمجة اللاجينية.

Protocol

تم التعامل مع المربين البالغين ومعالجتهم وفقا لبروتوكول استخدام الحيوانات المعتمد من لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) (# 20180063) في جامعة كاليفورنيا ، ريفرسايد. 1. جمع أجنة الزرد والتعرض الكيميائي أضف مصائد تربية داخل الخزان إلى الخزانات التي تحتوي ع…

Representative Results

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تحديد ما إذا كان العلاج يؤثر على الوفرة النسبية ل 5 مللي مئوية من خلال تقييم المساحة الإجمالية والكثافة النسبية للتألق داخل أجنة الزرد الثابتة والموسمة. بعد الانتهاء من البروتوكول ، يمكن استخدام المجهر المجسم الفلوري لتحديد ما إذا كان IHC بالكامل ناجحا أم ل?…

Discussion

خلال هذا البروتوكول ، هناك بعض الخطوات الحاسمة. أولا ، عند إزالة الأجنة ، من المهم توجيه الإبرة بعيدا عن أنسجة كيس الجنين / كيس الصفار / كتلة الخلية ، لأن هذه الأجزاء من الجنين النامي هشة للغاية ويسهل ثقبها. ثانيا ، عند نقل الأجنة المصنفة إلى آبار فردية ، استخدم ماصة زجاجية لنقل الأجنة لأنها …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تقديم الدعم البحثي من خلال زمالة قسم الدراسات العليا في UCR إلى SAB ، وزمالة برنامج تدريب NRSA T32 (T32ES018827) إلى SAB ، ومنحة المعاهد الوطنية للصحة (R01ES027576) ومشروع هاتش المعهد الوطني للأغذية والزراعة التابع لوزارة الزراعة الأمريكية (1009609) إلى DCV.

Materials

1.5-mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 540225
10-µL glass microcapillary pipette Fisher Scientific 211762B
100-mm plastic Petri dish Fisher Scientific 08757100D
10x phosphate-buffered saline  Fisher Scientific BP399500
1-mL pipette  Fisher Scientific 13690032
250-mL Erlenmeyer flask Fisher Scientific FB501250
5-mL pipette Fisher Scientific 13690033
60-mm glass petri dishes with lids Fisher Scientific 08747A
96-well plate Fisher Scientific 720089
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody  Fisher Scientific A21121
Bovine serum albumin Fisher Scientific BP67110
DMSO Fisher Scientific BP2311
Hotplate  Fisher Scientific 1110016SH
In-tank breeding traps Aquatic Habitats N/A This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.  Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.
ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System Molecular Devices N/A Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.
Immunochemistry (IHC) basket N/A N/A Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.
MetaXpress 6.0.3.1658  Molecular Devices N/A Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.
Microspatula Fisher Scientific 2140115
Monoclonal mouse anti-5-mC antibody Millipore Sigma MABE146
NaOH Fisher Scientific BP359-500
Orbital shaker  Fisher Scientific 50998290
Parafilm  Fisher Scientific 1337412
Paraformaldehyde  Fisher Scientific 18612139
Plastic transfer pipette Fisher Scientific 1368050
Rstudio RStudio N/A RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.
Sheep serum Millipore Sigma S3772-5ML
Stereomicroscope Leica 10450103
Temperature-controlled incubator  Fisher Scientific PR505755L
Tween-20  Fisher Scientific P7949-500ML

References

  1. Zhang, H. -. Y., Xiong, J., Qi, B. -. L., Feng, Y. -. Q., Yuan, B. -. F. The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals. Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).
  2. Huang, W., et al. Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA. Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).
  3. Avila-Barnard, S., et al. Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos. Environmental Research. 211, 113078 (2022).
  4. Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning. Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).
  5. Vliet, S. M. F., et al. Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).
  6. Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly. Environmental Science & Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).
  7. Dasgupta, S., et al. Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish. Environmental Science & Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).
  8. McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure. Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).
  9. Geiman, T. M., Muegge, K. DNA methylation in early development. Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).
  10. Wossidlo, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).
  11. Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. DNA methylation-mediated epigenetic control. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).
  12. Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).
  13. Ooi, S. K. T., O’Donnell, A. H., Bestor, T. H. Mammalian cytosine methylation at a glance. Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).
  14. Baylin, S. B., Jones, P. A. A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications. Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).
  15. Robertson, K. D. DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web. Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).
  16. Robertson, K. D. DNA methylation and human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).
  17. Greenberg, M. V. C., Bourc’his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
  18. Yuan, B. -. F., Feng, Y. -. Q. Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products. Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).
  19. Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).

Play Video

Cite This Article
Avila-Barnard, S., Volz, D. C. Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (186), e64190, doi:10.3791/64190 (2022).

View Video