Lentivirüs Aracılı CRISPR / Cas9 Gen Düzenleme Kullanarak Nakavt Kas Hücre Hatlarının Geliştirilmesi
Summary
Protokol, kılavuz-RNA’ların tasarımından hücresel klonlamaya ve nakavt klonlarının karakterizasyonuna kadar CRISPR / Cas9 kullanarak nakavt miyoblastlarının nasıl üretileceğini açıklar.
Abstract
Kümelenmiş düzenleyici aralıklı kısa palindromik tekrarların (CRISPR) / Cas 9’un önemli bir uygulaması, özellikle genetik tanı sırasında tanımlanan bir hastalıkla ilişkili yeni genlerin / proteinlerin işlevini incelemek için nakavt hücre hatlarının geliştirilmesidir. Bu tür hücre hatlarının gelişimi için, iki ana konunun çözülmesi gerekir: CRISPR araçlarının (Cas9 ve kılavuz RNA) seçilen hücrelere yüksek verimlilikle yerleştirilmesi ve Cas9 aktivitesinin seçilen genin spesifik olarak silinmesiyle sınırlandırılması. Burada açıklanan protokol, CRISPR araçlarının kas hücreleri gibi transfekte edilmesi zor hücrelere yerleştirilmesine adanmıştır. Bu protokol, halka açık plazmidlerle üretilen lentivirüslerin kullanımına dayanmaktadır ve tüm klonlama adımlarının ilgilenilen bir geni hedeflemek için tanımlandığı bilinmektedir. Cas9 aktivitesinin kontrolü, Cas9’u hedef alan bir kılavuz RNA’yı kodlayan bir lentivirüs ile hücrelerin transdüksiyonunun Cas9 ekspresyonunun aşamalı olarak ortadan kaldırılmasına izin verdiği KamiCas9 adı verilen daha önce tanımlanmış bir sistemin adaptasyonu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu protokol, kas hücre içi kalsiyum salınımında ve uyarım-kasılma eşleşmesinde yer alan bu önemli kalsiyum kanalının nakavtını doğrulamak için protein ve fonksiyonel düzeyde daha da karakterize edilen bir RYR1-nakavt insan kas hücresi hattının geliştirilmesine uygulanmıştır. Burada açıklanan prosedür, kas hücrelerindeki diğer genlere veya transfekte edilmesi zor diğer hücrelere kolayca uygulanabilir ve bu genleri insan hücrelerinde incelemek için değerli araçlar üretebilir.
Introduction
Gen diziliminin ilerlemesi ve belirli bir dokudaki bilinmeyen fonksiyonlara sahip genlerdeki mutasyonların tanımlanmasıyla, yeni bir hedef genin işlevini anlamak ve ilgili patofizyolojik mekanizmalara katılımını doğrulamak için ilgili hücresel modellerin geliştirilmesi önemli bir araç oluşturmaktadır. Ek olarak, bu modeller gelecekteki terapötik gelişmeler için büyük önem taşımaktadır 1,2 ve deneylerde hayvanların kullanımının azaltılmasına yönelik uluslararası önerilerle aynı doğrultuda nakavt hayvan modellerinin geliştirilmesine ilginç bir alternatif oluşturmaktadır. CRISPR / Cas9 kullanarak gen düzenleme, şu anda mevcut olan en güçlü araçlar arasındadır, bu da birçok nakavt / knock-in modelinin geliştirilmesine izin vermiştir ve CRISPR / Cas9 kullanarak hedeflenen gen doğrulaması, CRISPR / Cas93’ün en yaygın kullanılan uygulamaları arasındadır. Gen düzenlemenin başarısı, hedef hücre modelinde CRISPR araçlarını (kılavuz RNA’lar ve nükleaz Cas9) tanıtma yeteneğine dayanır; bu,kas hücreleri 4 gibi transfekt edilmesi zor birçok hücrede zor olabilir. Bu zorluk, birçok hücre tipini verimli bir şekilde dönüştürmek ve transgenini iletmek için büyük avantaja sahip olan virüsün, genellikle lentivirüsün kullanılmasıyla aşılabilir. Ancak en büyük dezavantajı, transgenin konakçı hücre genomuna entegrasyonudur, bu da entegrasyon bölgesinde lokalize genlerin potansiyel olarak değişmesine ve transgenin kalıcı ekspresyonuna yol açar, bu da nükleaz Cas9 durumunda zararlı sonuçlara neden olur5. Merienne ve meslektaşları6 tarafından, Cas9 geninin kendisini hedef alan ve Cas9 inaktivasyonuna yol açan bir kılavuz-RNA’nın hücrelerine girişten oluşan akıllı bir çözüm önerilmiştir. Bu stratejinin bir uyarlaması, burada, transfekte edilmesi zor hücrelerdeki hemen hemen her genin yok edilmesine izin veren kullanıcı dostu ve çok yönlü bir protokol olarak sunulmaktadır.
Burada sunulan protokolün amacı, ölümsüzleştirilmiş kas hücrelerine ilgi duyan bir genin inaktivasyonunu indüklemektir. Farklı ölümsüzleştirilmiş hücre türlerinde ilgilenilen herhangi bir geni yok etmek için kullanılabilir. Burada açıklanan protokol, kılavuz RNA’ları ve bunların lentiviral plazmidlere klonlanmasını tasarlamak, lentiviral vektörlerde CRISPR araçlarını üretmek, hücreleri farklı lentivirüslerle dönüştürmek ve homojen düzenlenmiş bir hücre hattı üretmek için hücreleri klonlamak için adımlar içerir.
Bu protokolü kullanarak, ölümsüzleştirilmiş insan iskelet kası hücreleri, hücre içi kalsiyum salınımı ve kas kasılmasında rol oynayan temel bir kalsiyum kanalı olan tip 1 ryanodin reseptörünün (RyR1) silinmesiyle geliştirilmiştir7. Genin nakavtı (KO), Western blot kullanılarak protein seviyesinde ve kalsiyum görüntüleme kullanılarak fonksiyonel düzeyde doğrulanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Patolojilerde yer alan bilinmeyen fonksiyona sahip genlerin karakterizasyonuna giden yolda önemli bir adım, bu genlerin işlevini incelemek için ilgili hücresel modellerin geliştirilmesidir. CRISPR / Cas9 kullanarak gen düzenlemenin kullanımı katlanarak büyüyen bir araştırma alanıdır ve burada sunulduğu gibi nakavt modellerinin geliştirilmesi en yaygın kullanılan uygulamaları arasındadır. Bu bağlamda, burada, ilgilenilen herhangi bir gende bir insan hücre hattı nakavtı geliştirmek için çok yö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) ve Auvergne-Rhône Alpes Région’dan (AURA) gelen hibelerle finanse edildi.
Materials
| Anti-CACNA1S antibody | Sigma-Aldrich | HPA048892 | Primary antibody |
| Blp I | NE BioLabs | R0585S | Restriction enzyme |
| CalPhos Mammalian Transfection Kit | Takara | 631312 | Transfection kit |
| Easy blot anti Mouse IgG | GeneTex | GTX221667-01 | HRP secondary antibody |
| Easy blot anti Rabbit IgG | GeneTex | GTX221666 | HRP secondary antibody |
| Fluo-4 direct | Molecular Probes | F10472 | Calcium imaging |
| GAPDH(14C10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #2118 | Primary antibody |
| HindIII | Fermentas | ER0501 | Restriction enzyme |
| InFusion HD Precision Plus | Takara | 638920 | Ligation kit |
| MasterMix Phusion High Fidelity with GC | ThermoFisher Scientific | F532L | Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs |
| Myosin Heavy Chain antibody | DHSB | MF20 | Primary antibody |
| NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | REF 740424 | Maxipreparation kit for purification of plasmids |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609 | DNA purification |
| NucleoSpin Tissue | Macherey-Nagel | 740952 | Kit for DNA extraction from cell |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C737303 | Chemically competent cells |
| Plasmid #87904 | Addgene | 87904 | Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9) |
| Plasmid #87919 | Addgene | 87919 | Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target) |
| Plasmid #12260 | Addgene | 12260 | Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL |
| Plasmid #8454 | Addgene | 8454 | Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
| V5 Tag Monoclonal Antibody | Invitrogene | R96025 | Primary antibody |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | Chemically competent cells |
| Xma I | NE BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
- Claussnitzer, M., Susztak, K. Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries. Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).
- Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G. Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies. Genes. 11 (5), 473 (2020).
- Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications. Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).
- Olson, E. N. Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).
- Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. Target specificity of the CRISPR-Cas9 system. Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).
- Merienne, N., et al. The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes. Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).
- Marty, I., Fauré, J. Excitation-contraction coupling alterations in myopathies. Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
- Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers. The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).
- Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. A linear Lowry–Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins. Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).
- Garibaldi, M., et al. Dusty core disease’ (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3 (2019).
- Marty, I., et al. Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).
- Oddoux, S., et al. Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1, 34 (2011).
- Cacheux, M., et al. Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein. Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).
- Luis, A. The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology. Viruses. 12 (10), 1103 (2020).
- Leenay, R. T., Beisel, C. L. Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM. Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Neurosciences. , (2006).
