Разработка нокаутирующих мышечных клеточных линий с использованием лентивирусно-опосредованного редактирования генов CRISPR/Cas9
Summary
Протокол описывает, как генерировать нокаутирующие миобласты с помощью CRISPR/Cas9, начиная от проектирования направляющих РНК до клеточного клонирования и характеристики нокаутирующих клонов.
Abstract
Одним из важных применений кластерных регуляторных межпространственных коротких палиндромных повторов (CRISPR)/Cas 9 является разработка нокаутирующих клеточных линий, в частности, для изучения функции новых генов/белков, связанных с заболеванием, выявленных в ходе генетической диагностики. Для развития таких клеточных линий необходимо распутать две основные проблемы: вставка инструментов CRISPR (Cas9 и направляющая РНК) с высокой эффективностью в выбранные клетки и ограничение активности Cas9 специфической делецией выбранного гена. Протокол, описанный здесь, посвящен вставке инструментов CRISPR в трудно трансфектируемые клетки, такие как мышечные клетки. Этот протокол основан на использовании лентивирусов, продуцируемых с плазмидами, общедоступными, для которых все этапы клонирования описаны для нацеливания на интересующий ген. Контроль активности Cas9 был выполнен с использованием адаптации ранее описанной системы под названием KamiCas9, в которой трансдукция клеток лентивирусом, кодирующим направляющую РНК, нацеленную на Cas9, позволяет прогрессировать отмену экспрессии Cas9. Этот протокол был применен к разработке RYR1-нокаутирующей линии мышечных клеток человека, которая была дополнительно охарактеризована на белковом и функциональном уровне, чтобы подтвердить нокаут этого важного кальциевого канала, участвующего в внутриклеточном высвобождении кальция мышц и в связи возбуждение-сокращение. Процедура, описанная здесь, может быть легко применена к другим генам в мышечных клетках или в других трудно трансфектируемых клетках и производить ценные инструменты для изучения этих генов в клетках человека.
Introduction
С прогрессом секвенирования генов и идентификацией мутаций в генах неизвестных функций в конкретной ткани разработка соответствующих клеточных моделей для понимания функции нового гена-мишени и подтверждения его участия в связанных патофизиологических механизмах представляет собой важный инструмент. Кроме того, эти модели имеют большое значение для будущих терапевтических разработок 1,2 и представляют собой интересную альтернативу разработке нокаутированных моделей животных в прямой линии с международными рекомендациями по сокращению использования животных в экспериментах. Редактирование генов с использованием CRISPR / Cas9 является одним из самых мощных инструментов, доступных в настоящее время, что позволило разработать множество нокаут-моделей, а целевая проверка генов с использованием CRISPR / Cas9 является одним из наиболее широко используемых применений CRISPR / Cas93. Успех редактирования генов зависит от способности вводить инструменты CRISPR (направляющие РНК и нуклеазу Cas9) в модель клеток-мишеней, что может быть проблемой во многих труднопереводимых клетках, таких как мышечные клетки4. Эта проблема может быть преодолена с помощью вируса, обычно лентивируса, который имеет большое преимущество для эффективного преобразования многих типов клеток и доставки их трансгена. Но его основным недостатком является интеграция трансгена в геном клетки-хозяина, что приводит к потенциальному изменению генов, локализованных в месте интеграции, и к постоянной экспрессии трансгена, что в случае нуклеазы Cas9 приведет к разрушительным последствиям5. Умный раствор был предложен Мерьенн и его коллегами6, который состоит из введения в клетки направляющей РНК, нацеленной на сам ген Cas9, что приводит к инактивации Cas9. Адаптация этой стратегии представлена здесь в виде удобного и универсального протокола, позволяющего нокаутировать практически любой ген в труднотрансфектируемых клетках.
Целью представленного здесь протокола является индуцирование инактивации гена, представляющего интерес, в увековеченных мышечных клетках. Его можно использовать для нокаутирования любого гена, представляющего интерес, в различных типах увековеченных клеток. Протокол, описанный здесь, содержит шаги по разработке направляющих РНК и их клонированию в лентивирусные плазмиды, для производства инструментов CRISPR в лентивирусных векторах, для трансдукции клеток с различными лентивирусами и для клонирования клеток для получения однородной отредактированной клеточной линии.
Используя этот протокол, были разработаны увековеченные клетки скелетных мышц человека с делецией рецептора рианодина типа 1 (RyR1), важного кальциевого канала, участвующего во внутриклеточном высвобождении кальция и сокращении мышц7. Нокаут (KO) гена был подтвержден на уровне белка с использованием вестерн-блоттинга и на функциональном уровне с использованием кальциевой визуализации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важным шагом на пути к характеристике генов неизвестной функции, участвующих в патологиях, является разработка соответствующих клеточных моделей для изучения функции этих генов. Использование редактирования генов с использованием CRISPR / Cas9 является экспоненциально растущей областью …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась за счет грантов Французской ассоциации по борьбе с миопатиями (AFM-Téléthon) и Овернь-Роны Альпы Режион (AURA).
Materials
| Anti-CACNA1S antibody | Sigma-Aldrich | HPA048892 | Primary antibody |
| Blp I | NE BioLabs | R0585S | Restriction enzyme |
| CalPhos Mammalian Transfection Kit | Takara | 631312 | Transfection kit |
| Easy blot anti Mouse IgG | GeneTex | GTX221667-01 | HRP secondary antibody |
| Easy blot anti Rabbit IgG | GeneTex | GTX221666 | HRP secondary antibody |
| Fluo-4 direct | Molecular Probes | F10472 | Calcium imaging |
| GAPDH(14C10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #2118 | Primary antibody |
| HindIII | Fermentas | ER0501 | Restriction enzyme |
| InFusion HD Precision Plus | Takara | 638920 | Ligation kit |
| MasterMix Phusion High Fidelity with GC | ThermoFisher Scientific | F532L | Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs |
| Myosin Heavy Chain antibody | DHSB | MF20 | Primary antibody |
| NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | REF 740424 | Maxipreparation kit for purification of plasmids |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609 | DNA purification |
| NucleoSpin Tissue | Macherey-Nagel | 740952 | Kit for DNA extraction from cell |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C737303 | Chemically competent cells |
| Plasmid #87904 | Addgene | 87904 | Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9) |
| Plasmid #87919 | Addgene | 87919 | Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target) |
| Plasmid #12260 | Addgene | 12260 | Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL |
| Plasmid #8454 | Addgene | 8454 | Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
| V5 Tag Monoclonal Antibody | Invitrogene | R96025 | Primary antibody |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | Chemically competent cells |
| Xma I | NE BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
- Claussnitzer, M., Susztak, K. Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries. Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).
- Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G. Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies. Genes. 11 (5), 473 (2020).
- Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications. Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).
- Olson, E. N. Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).
- Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. Target specificity of the CRISPR-Cas9 system. Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).
- Merienne, N., et al. The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes. Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).
- Marty, I., Fauré, J. Excitation-contraction coupling alterations in myopathies. Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
- Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers. The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).
- Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. A linear Lowry–Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins. Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).
- Garibaldi, M., et al. Dusty core disease’ (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3 (2019).
- Marty, I., et al. Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).
- Oddoux, S., et al. Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1, 34 (2011).
- Cacheux, M., et al. Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein. Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).
- Luis, A. The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology. Viruses. 12 (10), 1103 (2020).
- Leenay, R. T., Beisel, C. L. Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM. Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Neurosciences. , (2006).
