Sviluppo di linee cellulari muscolari knock-out utilizzando l'editing genetico CRISPR/Cas9 mediato da lentivirus
Summary
Il protocollo descrive come generare mioblasti knock-out utilizzando CRISPR/Cas9, partendo dalla progettazione di RNA guida alla clonazione cellulare e alla caratterizzazione dei cloni knock-out.
Abstract
Un’importante applicazione delle ripetizioni palindrome brevi intervallate regolatorie raggruppate (CRISPR)/Cas 9 è lo sviluppo di linee cellulari knock-out, in particolare per studiare la funzione di nuovi geni/proteine associati a una malattia, identificati durante la diagnosi genetica. Per lo sviluppo di tali linee cellulari, due questioni principali devono essere districate: l’inserimento degli strumenti CRISPR (il Cas9 e l’RNA guida) ad alta efficienza nelle cellule scelte e la restrizione dell’attività Cas9 alla delezione specifica del gene scelto. Il protocollo qui descritto è dedicato all’inserimento degli strumenti CRISPR in cellule difficili da trasfettare, come le cellule muscolari. Questo protocollo si basa sull’uso di lentivirus, prodotti con plasmidi pubblicamente disponibili, per i quali vengono descritte tutte le fasi di clonazione per colpire un gene di interesse. Il controllo dell’attività di Cas9 è stato effettuato utilizzando un adattamento di un sistema precedentemente descritto chiamato KamiCas9, in cui la trasduzione delle cellule con un lentivirus che codifica un RNA guida mirato al Cas9 consente la progressiva abolizione dell’espressione di Cas9. Questo protocollo è stato applicato allo sviluppo di una linea cellulare muscolare umana RYR1-knock out, che è stata ulteriormente caratterizzata a livello proteico e funzionale, per confermare il knockout di questo importante canale del calcio coinvolto nel rilascio intracellulare di calcio muscolare e nell’accoppiamento eccitazione-contrazione. La procedura qui descritta può essere facilmente applicata ad altri geni nelle cellule muscolari o in altre cellule difficili da trasfettare e produrre strumenti preziosi per studiare questi geni nelle cellule umane.
Introduction
Con il progredire del sequenziamento genico e l’identificazione di mutazioni in geni di funzioni sconosciute in un tessuto specifico, lo sviluppo di modelli cellulari rilevanti per comprendere la funzione di un nuovo gene bersaglio e confermare il suo coinvolgimento nei relativi meccanismi fisiopatologici costituisce uno strumento essenziale. Inoltre, questi modelli sono di grande importanza per i futuri sviluppi terapeutici 1,2 e costituiscono un’interessante alternativa allo sviluppo di modelli animali knock-out in linea retta con le raccomandazioni internazionali per la riduzione dell’uso di animali nella sperimentazione. L’editing genetico con CRISPR/Cas9 è tra gli strumenti più potenti attualmente disponibili, che ha permesso lo sviluppo di molti modelli knock-out/knock-in, e la validazione genica mirata con CRISPR/Cas9 è tra le applicazioni più utilizzate di CRISPR/Cas93. Il successo dell’editing genetico si basa sulla capacità di introdurre gli strumenti CRISPR (gli RNA guida e la nucleasi Cas9) nel modello cellulare target, che può essere una sfida in molte cellule difficili da trasfettare, come le cellule muscolari4. Questa sfida può essere superata con l’uso del virus, di solito lentivirus, che ha il grande vantaggio di trasdurre in modo efficiente molti tipi di cellule e fornire il suo transgene. Ma il suo principale svantaggio è l’integrazione del transgene nel genoma della cellula ospite, che porta a una potenziale alterazione dei geni localizzati nel sito di integrazione e all’espressione permanente del transgene, che nel caso della nucleasi Cas9 comporterebbe conseguenze dannose5. Merienne e colleghi6 hanno proposto una soluzione intelligente, che consiste nell’introduzione nelle cellule di un RNA guida mirato al gene Cas9 stesso, portando all’inattivazione di Cas9. Un adattamento di questa strategia è presentato qui come un protocollo facile da usare e versatile che consente di eliminare praticamente qualsiasi gene in cellule difficili da trasfettare.
L’obiettivo del protocollo qui presentato è quello di indurre l’inattivazione di un gene di interesse nelle cellule muscolari immortalizzate. Può essere usato per mettere fuori uso qualsiasi gene di interesse, in diversi tipi di cellule immortalizzate. Il protocollo qui descritto contiene passaggi per progettare gli RNA guida e la loro clonazione in plasmidi lentivirali, per produrre gli strumenti CRISPR in vettori lentivirali, per trasdurre le cellule con i diversi lentivirus e per clonare le cellule per produrre una linea cellulare omogenea modificata.
Utilizzando questo protocollo, sono state sviluppate cellule muscolari scheletriche umane immortalizzate con delezione del recettore della rianodina di tipo 1 (RyR1), un canale del calcio essenziale coinvolto nel rilascio intracellulare del calcio e nella contrazione muscolare7. Il knock-out (KO) del gene è stato confermato a livello proteico utilizzando Western blot e a livello funzionale utilizzando l’imaging del calcio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un passo importante sulla strada verso la caratterizzazione di geni di funzione sconosciuta coinvolti in patologie è lo sviluppo di modelli cellulari rilevanti per studiare la funzione di questi geni. L’uso dell’editing genetico utilizzando CRISPR / Cas9 è un campo di ricerca in crescita esponenziale e lo sviluppo di modelli knock-out come presentato qui è tra le sue applicazioni più utilizzate. In questo contesto, proponiamo qui un protocollo versatile per sviluppare un knock-out della linea cellulare umana in quals…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dell’Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) e dell’Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).
Materials
| Anti-CACNA1S antibody | Sigma-Aldrich | HPA048892 | Primary antibody |
| Blp I | NE BioLabs | R0585S | Restriction enzyme |
| CalPhos Mammalian Transfection Kit | Takara | 631312 | Transfection kit |
| Easy blot anti Mouse IgG | GeneTex | GTX221667-01 | HRP secondary antibody |
| Easy blot anti Rabbit IgG | GeneTex | GTX221666 | HRP secondary antibody |
| Fluo-4 direct | Molecular Probes | F10472 | Calcium imaging |
| GAPDH(14C10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #2118 | Primary antibody |
| HindIII | Fermentas | ER0501 | Restriction enzyme |
| InFusion HD Precision Plus | Takara | 638920 | Ligation kit |
| MasterMix Phusion High Fidelity with GC | ThermoFisher Scientific | F532L | Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs |
| Myosin Heavy Chain antibody | DHSB | MF20 | Primary antibody |
| NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | REF 740424 | Maxipreparation kit for purification of plasmids |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609 | DNA purification |
| NucleoSpin Tissue | Macherey-Nagel | 740952 | Kit for DNA extraction from cell |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C737303 | Chemically competent cells |
| Plasmid #87904 | Addgene | 87904 | Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9) |
| Plasmid #87919 | Addgene | 87919 | Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target) |
| Plasmid #12260 | Addgene | 12260 | Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL |
| Plasmid #8454 | Addgene | 8454 | Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
| V5 Tag Monoclonal Antibody | Invitrogene | R96025 | Primary antibody |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | Chemically competent cells |
| Xma I | NE BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
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