تطوير خطوط خلايا العضلات بالضربة القاضية باستخدام تحرير الجينات CRISPR / Cas9 بوساطة فيروس Lentivirus
Summary
يصف البروتوكول كيفية توليد الخلايا العضلية بالضربة القاضية باستخدام CRISPR / Cas9 ، بدءا من تصميم الحمض النووي الريبي الموجه إلى الاستنساخ الخلوي وتوصيف النسخ القاضية.
Abstract
أحد التطبيقات المهمة للتكرارات الباليندرومية القصيرة المجمعة بين المسافات (CRISPR) / Cas 9 هو تطوير خطوط الخلايا القاضية ، وتحديدا لدراسة وظيفة الجينات / البروتينات الجديدة المرتبطة بالمرض ، والتي تم تحديدها أثناء التشخيص الجيني. لتطوير مثل هذه الخطوط الخلوية ، يجب فك تشابك قضيتين رئيسيتين: إدخال أدوات كريسبر (Cas9 والحمض النووي الريبي الدليلي) بكفاءة عالية في الخلايا المختارة ، وتقييد نشاط Cas9 على الحذف المحدد للجين المختار. البروتوكول الموصوف هنا مخصص لإدخال أدوات كريسبر في الخلايا التي يصعب نقلها، مثل الخلايا العضلية. ويستند هذا البروتوكول إلى استخدام فيروسات lentiviruses، التي يتم إنتاجها باستخدام البلازميدات المتاحة للجمهور، والتي يتم وصف جميع خطوات الاستنساخ الخاصة بها لاستهداف جين ذي أهمية. تم إجراء التحكم في نشاط Cas9 باستخدام تكييف لنظام موصوف سابقا يسمى KamiCas9 ، حيث يسمح نقل الخلايا باستخدام فيروس lentivirus بتشفير الحمض النووي الريبي الإرشادي الذي يستهدف Cas9 بالإلغاء التدريجي لتعبير Cas9. تم تطبيق هذا البروتوكول على تطوير خط خلايا العضلات البشرية RYR1-knock ، والذي تم تمييزه بشكل أكبر على المستوى البروتيني والوظيفي ، لتأكيد خروج قناة الكالسيوم المهمة هذه المشاركة في إطلاق الكالسيوم داخل الخلايا في العضلات وفي اقتران الإثارة والانكماش. يمكن بسهولة تطبيق الإجراء الموصوف هنا على جينات أخرى في خلايا العضلات أو في خلايا أخرى يصعب نقلها وإنتاج أدوات قيمة لدراسة هذه الجينات في الخلايا البشرية.
Introduction
مع تقدم تسلسل الجينات وتحديد الطفرات في الجينات ذات الوظائف غير المعروفة في نسيج معين ، فإن تطوير النماذج الخلوية ذات الصلة لفهم وظيفة الجين المستهدف الجديد وتأكيد مشاركته في الآليات الفسيولوجية المرضية ذات الصلة يشكل أداة أساسية. بالإضافة إلى ذلك ، هذه النماذج ذات أهمية كبيرة للتطورات العلاجية المستقبلية 1,2 ، وتشكل بديلا مثيرا للاهتمام لتطوير نماذج حيوانية بالضربة القاضية بما يتماشى بشكل مستقيم مع التوصيات الدولية للحد من استخدام الحيوانات في التجريب. يعد تحرير الجينات باستخدام CRISPR / Cas9 من بين أقوى الأدوات المتاحة حاليا ، مما سمح بتطوير العديد من نماذج الضربة القاضية / الضربة القاضية ، والتحقق من صحة الجينات المستهدفة باستخدام CRISPR / Cas9 هو من بين التطبيقات الأكثر استخداما على نطاق واسع ل CRISPR / Cas93. يعتمد نجاح تحرير الجينات على القدرة على إدخال أدوات كريسبر (الحمض النووي الريبي الإرشادي و nuclease Cas9) في نموذج الخلية المستهدفة ، والتي يمكن أن تشكل تحديا في العديد من الخلايا التي يصعب نقلها ، مثل خلايا العضلات4. يمكن التغلب على هذا التحدي باستخدام الفيروس ، وعادة ما يكون الفيروس lentivirus ، والذي يتمتع بميزة كبيرة لنقل العديد من أنواع الخلايا بكفاءة وتقديم الجينات المحورة. لكن عيبه الرئيسي هو دمج الجين المتحول في جينوم الخلية المضيفة ، مما يؤدي إلى تغيير محتمل في الجينات الموضعية في موقع التكامل وإلى التعبير الدائم عن الجين المتحول ، والذي في حالة nuclease Cas9 سيؤدي إلى عواقب وخيمة5. تم اقتراح حل ذكي من قبل Merienne وزملاؤه6 ، والذي يتكون من إدخال الحمض النووي الريبي الإرشادي في الخلايا الذي يستهدف جين Cas9 نفسه ، مما يؤدي إلى تعطيل Cas9. يتم تقديم تكييف لهذه الاستراتيجية هنا كبروتوكول سهل الاستخدام ومتعدد الاستخدامات يسمح بضرب أي جين تقريبا في الخلايا التي يصعب نقلها.
الهدف من البروتوكول المقدم هنا هو الحث على تعطيل جين ذي أهمية في خلايا العضلات الخالدة. يمكن استخدامه للقضاء على أي جين ذي أهمية ، في أنواع مختلفة من الخلايا الخالدة. يحتوي البروتوكول الموصوف هنا على خطوات لتصميم الحمض النووي الريبي الإرشادي واستنساخها إلى بلازميدات فيروسية ، لإنتاج أدوات كريسبر في ناقلات الفيروسات اللينتيفيروسية ، لتحويل الخلايا باستخدام فيروسات لينتيفيروسات مختلفة ، واستنساخ الخلايا لإنتاج خط خلوي محرر متجانس.
باستخدام هذا البروتوكول ، تم تطوير خلايا العضلات الهيكلية البشرية المخلدة مع حذف مستقبلات الريانودين من النوع الأول (RyR1) ، وهي قناة كالسيوم أساسية تشارك في إطلاق الكالسيوم داخل الخلايا وتقلص العضلات7. تم تأكيد خروج الضربة القاضية (KO) للجين على مستوى البروتين باستخدام اللطخة الغربية ، وعلى المستوى الوظيفي باستخدام تصوير الكالسيوم.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتمثل إحدى الخطوات الرئيسية على الطريق إلى توصيف الجينات ذات الوظيفة غير المعروفة المشاركة في الأمراض في تطوير نماذج خلوية ذات صلة لدراسة وظيفة هذه الجينات. يعد استخدام تحرير الجينات باستخدام CRISPR / Cas9 مجالا بحثيا متناميا بشكل كبير ، ويعد تطوير نماذج خروج المغلوب كما هو موضح هنا من بين أكث?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من خلال منح من الرابطة الفرنسية لمكافحة اعتلال العضلات (AFM-Téléthon) ومن Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).
Materials
| Anti-CACNA1S antibody | Sigma-Aldrich | HPA048892 | Primary antibody |
| Blp I | NE BioLabs | R0585S | Restriction enzyme |
| CalPhos Mammalian Transfection Kit | Takara | 631312 | Transfection kit |
| Easy blot anti Mouse IgG | GeneTex | GTX221667-01 | HRP secondary antibody |
| Easy blot anti Rabbit IgG | GeneTex | GTX221666 | HRP secondary antibody |
| Fluo-4 direct | Molecular Probes | F10472 | Calcium imaging |
| GAPDH(14C10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #2118 | Primary antibody |
| HindIII | Fermentas | ER0501 | Restriction enzyme |
| InFusion HD Precision Plus | Takara | 638920 | Ligation kit |
| MasterMix Phusion High Fidelity with GC | ThermoFisher Scientific | F532L | Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs |
| Myosin Heavy Chain antibody | DHSB | MF20 | Primary antibody |
| NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | REF 740424 | Maxipreparation kit for purification of plasmids |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609 | DNA purification |
| NucleoSpin Tissue | Macherey-Nagel | 740952 | Kit for DNA extraction from cell |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C737303 | Chemically competent cells |
| Plasmid #87904 | Addgene | 87904 | Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9) |
| Plasmid #87919 | Addgene | 87919 | Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target) |
| Plasmid #12260 | Addgene | 12260 | Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL |
| Plasmid #8454 | Addgene | 8454 | Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
| V5 Tag Monoclonal Antibody | Invitrogene | R96025 | Primary antibody |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | Chemically competent cells |
| Xma I | NE BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
- Claussnitzer, M., Susztak, K. Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries. Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).
- Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G. Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies. Genes. 11 (5), 473 (2020).
- Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications. Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).
- Olson, E. N. Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).
- Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. Target specificity of the CRISPR-Cas9 system. Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).
- Merienne, N., et al. The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes. Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).
- Marty, I., Fauré, J. Excitation-contraction coupling alterations in myopathies. Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
- Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers. The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).
- Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. A linear Lowry–Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins. Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).
- Garibaldi, M., et al. Dusty core disease’ (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3 (2019).
- Marty, I., et al. Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).
- Oddoux, S., et al. Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1, 34 (2011).
- Cacheux, M., et al. Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein. Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).
- Luis, A. The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology. Viruses. 12 (10), 1103 (2020).
- Leenay, R. T., Beisel, C. L. Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM. Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Neurosciences. , (2006).
