Développement de lignées cellulaires musculaires Knock-Out à l’aide de l’édition de gènes CRISPR/Cas9 médiée par le lentivirus
Summary
Le protocole décrit comment générer des myoblastes knock-out à l’aide de CRISPR/Cas9, de la conception des ARN guides au clonage cellulaire et à la caractérisation des clones knock-out.
Abstract
Une application importante des courtes répétitions palindromiques régulatrices groupées (CRISPR) / Cas 9 est le développement de lignées cellulaires knock-out, en particulier pour étudier la fonction de nouveaux gènes / protéines associés à une maladie, identifiés lors du diagnostic génétique. Pour le développement de telles lignées cellulaires, deux questions majeures doivent être démêlées : l’insertion des outils CRISPR (le Cas9 et l’ARN guide) avec une grande efficacité dans les cellules choisies, et la restriction de l’activité Cas9 à la délétion spécifique du gène choisi. Le protocole décrit ici est dédié à l’insertion des outils CRISPR dans des cellules difficiles à transfecter, telles que les cellules musculaires. Ce protocole est basé sur l’utilisation de lentivirus, produits avec des plasmides accessibles au public, pour lesquels toutes les étapes de clonage sont décrites pour cibler un gène d’intérêt. Le contrôle de l’activité de Cas9 a été réalisé à l’aide d’une adaptation d’un système précédemment décrit appelé KamiCas9, dans lequel la transduction des cellules avec un lentivirus codant pour un ARN guide ciblant le Cas9 permet l’abolition progressive de l’expression de Cas9. Ce protocole a été appliqué au développement d’une lignée cellulaire musculaire humaine RYR1-knock-out, qui a été caractérisée au niveau protéique et fonctionnel, pour confirmer l’élimination de cet important canal calcique impliqué dans la libération de calcium intracellulaire musculaire et dans le couplage excitation-contraction. La procédure décrite ici peut facilement être appliquée à d’autres gènes dans les cellules musculaires ou dans d’autres cellules difficiles à transfecter et produire des outils précieux pour étudier ces gènes dans les cellules humaines.
Introduction
Avec les progrès du séquençage des gènes et l’identification de mutations dans les gènes de fonctions inconnues dans un tissu spécifique, le développement de modèles cellulaires pertinents pour comprendre la fonction d’un nouveau gène cible et confirmer son implication dans les mécanismes physiopathologiques connexes constitue un outil essentiel. En outre, ces modèles sont d’une importance majeure pour les développements thérapeutiques futurs 1,2 et constituent une alternative intéressante au développement de modèles animaux knock-out en ligne droite avec les recommandations internationales pour la réduction de l’utilisation d’animaux dans l’expérimentation. L’édition de gènes à l’aide de CRISPR/Cas9 est l’un des outils les plus puissants actuellement disponibles, ce qui a permis le développement de nombreux modèles knock-out/knock-in, et la validation ciblée de gènes à l’aide de CRISPR/Cas9 est l’une des applications les plus utilisées de CRISPR/Cas93. Le succès de l’édition de gènes repose sur la capacité d’introduire les outils CRISPR (les ARN guides et la nucléase Cas9) dans le modèle cellulaire cible, ce qui peut être un défi dans de nombreuses cellules difficiles à transfecter, telles que les cellules musculaires4. Ce défi peut être surmonté avec l’utilisation de virus, généralement le lentivirus, qui a le grand avantage de transduire efficacement de nombreux types de cellules et de délivrer son transgène. Mais son inconvénient majeur est l’intégration du transgène dans le génome de la cellule hôte, conduisant à une altération potentielle des gènes localisés sur le site d’intégration et à l’expression permanente du transgène, ce qui, dans le cas de la nucléase Cas9, entraînerait des conséquences dommageables5. Une solution intelligente a été proposée par Merienne et ses collègues6, qui consiste à introduire dans les cellules un ARN-guide ciblant le gène Cas9 lui-même, conduisant à l’inactivation de Cas9. Une adaptation de cette stratégie est présentée ici comme un protocole convivial et polyvalent permettant d’éliminer pratiquement n’importe quel gène dans les cellules difficiles à transfecter.
Le but du protocole présenté ici est d’induire l’inactivation d’un gène d’intérêt dans les cellules musculaires immortalisées. Il peut être utilisé pour éliminer n’importe quel gène d’intérêt, dans différents types de cellules immortalisées. Le protocole décrit ici contient des étapes pour concevoir les ARN guides et leur clonage en plasmides lentiviraux, pour produire les outils CRISPR dans des vecteurs lentiviraux, pour transduire les cellules avec les différents lentivirus et pour cloner les cellules pour produire une lignée cellulaire modifiée homogène.
En utilisant ce protocole, des cellules musculaires squelettiques humaines immortalisées ont été développées avec délétion du récepteur de la ryanodine de type 1 (RyR1), un canal calcique essentiel impliqué dans la libération intracellulaire du calcium et la contraction musculaire7. L’élimination (KO) du gène a été confirmée au niveau de la protéine à l’aide du transfert Western et au niveau fonctionnel à l’aide de l’imagerie calcique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une étape majeure sur la voie de la caractérisation des gènes de fonction inconnue impliqués dans les pathologies est le développement de modèles cellulaires pertinents pour étudier la fonction de ces gènes. L’utilisation de l’édition de gènes à l’aide de CRISPR / Cas9 est un domaine de recherche en croissance exponentielle, et le développement de modèles knock-out tels que présentés ici est l’une de ses applications les plus largement utilisées. Dans ce contexte, nous proposons ici un protocole p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été financés par des subventions de l’Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) et d’Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).
Materials
| Anti-CACNA1S antibody | Sigma-Aldrich | HPA048892 | Primary antibody |
| Blp I | NE BioLabs | R0585S | Restriction enzyme |
| CalPhos Mammalian Transfection Kit | Takara | 631312 | Transfection kit |
| Easy blot anti Mouse IgG | GeneTex | GTX221667-01 | HRP secondary antibody |
| Easy blot anti Rabbit IgG | GeneTex | GTX221666 | HRP secondary antibody |
| Fluo-4 direct | Molecular Probes | F10472 | Calcium imaging |
| GAPDH(14C10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #2118 | Primary antibody |
| HindIII | Fermentas | ER0501 | Restriction enzyme |
| InFusion HD Precision Plus | Takara | 638920 | Ligation kit |
| MasterMix Phusion High Fidelity with GC | ThermoFisher Scientific | F532L | Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs |
| Myosin Heavy Chain antibody | DHSB | MF20 | Primary antibody |
| NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | REF 740424 | Maxipreparation kit for purification of plasmids |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609 | DNA purification |
| NucleoSpin Tissue | Macherey-Nagel | 740952 | Kit for DNA extraction from cell |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C737303 | Chemically competent cells |
| Plasmid #87904 | Addgene | 87904 | Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9) |
| Plasmid #87919 | Addgene | 87919 | Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target) |
| Plasmid #12260 | Addgene | 12260 | Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL |
| Plasmid #8454 | Addgene | 8454 | Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
| V5 Tag Monoclonal Antibody | Invitrogene | R96025 | Primary antibody |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | Chemically competent cells |
| Xma I | NE BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
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