Ontwikkeling van knock-out spiercellijnen met behulp van Lentivirus-gemedieerde CRISPR / Cas9-genbewerking
Summary
Het protocol beschrijft hoe knock-out myoblasten kunnen worden gegenereerd met CRISPR / Cas9, van het ontwerp van guide-RNA’s tot het cellulair klonen en karakteriseren van de knock-out klonen.
Abstract
Een belangrijke toepassing van clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is de ontwikkeling van knock-out cellijnen, specifiek om de functie van nieuwe genen/eiwitten geassocieerd met een ziekte te bestuderen, geïdentificeerd tijdens de genetische diagnose. Voor de ontwikkeling van dergelijke cellijnen moeten twee belangrijke kwesties worden ontward: het inbrengen van de CRISPR-tools (het Cas9 en het gids-RNA) met een hoge efficiëntie in de gekozen cellen en beperking van de Cas9-activiteit tot de specifieke deletie van het gekozen gen. Het hier beschreven protocol is gewijd aan het inbrengen van de CRISPR-tools in moeilijk te transfecteren cellen, zoals spiercellen. Dit protocol is gebaseerd op het gebruik van lentivirussen, geproduceerd met plasmiden die openbaar beschikbaar zijn, waarvoor alle kloonstappen worden beschreven om zich te richten op een gen van belang. De controle van Cas9-activiteit is uitgevoerd met behulp van een aanpassing van een eerder beschreven systeem genaamd KamiCas9, waarbij de transductie van de cellen met een lentivirus dat codeert voor een gids-RNA gericht op de Cas9 de geleidelijke afschaffing van Cas9-expressie mogelijk maakt. Dit protocol is toegepast op de ontwikkeling van een RYR1-knock-out menselijke spiercellijn, die verder is gekarakteriseerd op eiwit- en functioneel niveau, om de knock-out van dit belangrijke calciumkanaal te bevestigen dat betrokken is bij de intracellulaire calciumafgifte van de spieren en bij excitatie-contractiekoppeling. De hier beschreven procedure kan gemakkelijk worden toegepast op andere genen in spiercellen of in andere moeilijk te transfecteren cellen en waardevolle hulpmiddelen produceren om deze genen in menselijke cellen te bestuderen.
Introduction
Met de voortgang van gensequencing en de identificatie van mutaties in genen met onbekende functies in een specifiek weefsel, vormt de ontwikkeling van relevante cellulaire modellen om de functie van een nieuw doelgen te begrijpen en de betrokkenheid ervan bij de gerelateerde pathofysiologische mechanismen te bevestigen een essentieel hulpmiddel. Daarnaast zijn deze modellen van groot belang voor toekomstige therapeutische ontwikkelingen 1,2, en vormen ze een interessant alternatief voor de ontwikkeling van knock-out diermodellen in rechte lijn met de internationale aanbevelingen voor vermindering van het gebruik van dieren bij experimenten. Genbewerking met CRISPR/Cas9 is een van de krachtigste tools die momenteel beschikbaar zijn, waardoor veel knock-out/knock-in modellen zijn ontwikkeld, en gerichte genvalidatie met CRISPR/Cas9 behoort tot de meest gebruikte toepassingen van CRISPR/Cas93. Het succes van genbewerking is afhankelijk van het vermogen om de CRISPR-tools (de gids RNA’s en de nuclease Cas9) in het doelcelmodel te introduceren, wat een uitdaging kan zijn in veel moeilijk te transfecteren cellen, zoals spiercellen4. Deze uitdaging kan worden overwonnen met het gebruik van virus, meestal lentivirus, dat het grote voordeel heeft om veel celtypen efficiënt te transduceren en zijn transgen te leveren. Maar het belangrijkste nadeel is de integratie van het transgen in het genoom van de gastheercel, wat leidt tot mogelijke verandering van genen gelokaliseerd op de integratieplaats en tot de permanente expressie van het transgen, wat in het geval van het nuclease Cas9 zou leiden tot schadelijke gevolgen5. Merienne en collega’s6 hebben een slimme oplossing voorgesteld, die bestaat uit de introductie in de cellen van een gids-RNA gericht op het Cas9-gen zelf, wat leidt tot Cas9-inactivatie. Een aanpassing van deze strategie wordt hier gepresenteerd als een gebruiksvriendelijk en veelzijdig protocol dat het mogelijk maakt om vrijwel elk gen in moeilijk te transfecteren cellen uit te schakelen.
Het doel van het hier gepresenteerde protocol is om de inactivatie van een gen van belang in vereeuwigde spiercellen te induceren. Het kan worden gebruikt om elk gen van belang uit te schakelen, in verschillende soorten onsterfelijke cellen. Het hier beschreven protocol bevat stappen om de gids RNA’s en hun klonen in lentivirale plasmiden te ontwerpen, om de CRISPR-tools in lentivirale vectoren te produceren, om de cellen met de verschillende lentivirussen te transduceren en om de cellen te klonen om een homogene bewerkte cellijn te produceren.
Met behulp van dit protocol zijn onsterfelijk gemaakte menselijke skeletspiercellen ontwikkeld met deletie van de type 1 ryanodinereceptor (RyR1), een essentieel calciumkanaal dat betrokken is bij intracellulaire calciumafgifte en spiercontractie7. De knock-out (KO) van het gen is bevestigd op eiwitniveau met behulp van Western blot en op functioneel niveau met behulp van calciumbeeldvorming.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een belangrijke stap op weg naar de karakterisering van genen met een onbekende functie die betrokken zijn bij pathologieën is de ontwikkeling van relevante cellulaire modellen om de functie van deze genen te bestuderen. Het gebruik van genbewerking met CRISPR/Cas9 is een exponentieel groeiend onderzoeksgebied en de ontwikkeling van knock-outmodellen zoals hier gepresenteerd is een van de meest gebruikte toepassingen. In deze context stellen we hier een veelzijdig protocol voor om een menselijke cellijn knock-out te ont…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) en van Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).
Materials
| Anti-CACNA1S antibody | Sigma-Aldrich | HPA048892 | Primary antibody |
| Blp I | NE BioLabs | R0585S | Restriction enzyme |
| CalPhos Mammalian Transfection Kit | Takara | 631312 | Transfection kit |
| Easy blot anti Mouse IgG | GeneTex | GTX221667-01 | HRP secondary antibody |
| Easy blot anti Rabbit IgG | GeneTex | GTX221666 | HRP secondary antibody |
| Fluo-4 direct | Molecular Probes | F10472 | Calcium imaging |
| GAPDH(14C10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #2118 | Primary antibody |
| HindIII | Fermentas | ER0501 | Restriction enzyme |
| InFusion HD Precision Plus | Takara | 638920 | Ligation kit |
| MasterMix Phusion High Fidelity with GC | ThermoFisher Scientific | F532L | Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs |
| Myosin Heavy Chain antibody | DHSB | MF20 | Primary antibody |
| NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | REF 740424 | Maxipreparation kit for purification of plasmids |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609 | DNA purification |
| NucleoSpin Tissue | Macherey-Nagel | 740952 | Kit for DNA extraction from cell |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C737303 | Chemically competent cells |
| Plasmid #87904 | Addgene | 87904 | Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9) |
| Plasmid #87919 | Addgene | 87919 | Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target) |
| Plasmid #12260 | Addgene | 12260 | Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL |
| Plasmid #8454 | Addgene | 8454 | Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
| V5 Tag Monoclonal Antibody | Invitrogene | R96025 | Primary antibody |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | Chemically competent cells |
| Xma I | NE BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
- Claussnitzer, M., Susztak, K. Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries. Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).
- Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G. Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies. Genes. 11 (5), 473 (2020).
- Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications. Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).
- Olson, E. N. Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).
- Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. Target specificity of the CRISPR-Cas9 system. Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).
- Merienne, N., et al. The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes. Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).
- Marty, I., Fauré, J. Excitation-contraction coupling alterations in myopathies. Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
- Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers. The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).
- Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. A linear Lowry–Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins. Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).
- Garibaldi, M., et al. Dusty core disease’ (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3 (2019).
- Marty, I., et al. Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).
- Oddoux, S., et al. Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1, 34 (2011).
- Cacheux, M., et al. Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein. Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).
- Luis, A. The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology. Viruses. 12 (10), 1103 (2020).
- Leenay, R. T., Beisel, C. L. Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM. Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Neurosciences. , (2006).
