Desenvolvimento de linhas de células musculares knock-out usando edição de genes CRISPR/Cas9 mediados por lentivírus
Summary
O protocolo descreve como gerar myoblasts knock-out usando CRISPR/Cas9, desde o design de guide-RNAs até a clonagem celular e caracterização dos clones knock-out.
Abstract
Uma importante aplicação de repetições palindômicas interespaçadas interespaçadas (CRISPR)/Cas 9 é o desenvolvimento de linhas celulares knock-out, especificamente para estudar a função de novos genes/proteínas associados a uma doença, identificada durante o diagnóstico genético. Para o desenvolvimento dessas linhas celulares, duas questões principais devem ser desemaranhadas: inserção das ferramentas CRISPR (o Cas9 e o guia RNA) com alta eficiência nas células escolhidas, e restrição da atividade Cas9 à exclusão específica do gene escolhido. O protocolo descrito aqui é dedicado à inserção das ferramentas CRISPR em células difíceis de transfeito, como células musculares. Este protocolo baseia-se no uso de lentivírus, produzidos com plasmídeos disponíveis publicamente, para os quais todas as etapas de clonagem são descritas para atingir um gene de interesse. O controle da atividade cas9 tem sido realizado usando uma adaptação de um sistema descrito anteriormente chamado KamiCas9, no qual a transdução das células com um lentivírus codificando um guia de RNA visando o Cas9 permite a abolição progressiva da expressão Cas9. Este protocolo tem sido aplicado ao desenvolvimento de uma linha de células musculares humanas RYR1-knock out, que tem sido ainda caracterizada no nível proteico e funcional, para confirmar o nocaute deste importante canal de cálcio envolvido na liberação de cálcio intracelular muscular e no acoplamento excitação-contração. O procedimento descrito aqui pode ser facilmente aplicado a outros genes em células musculares ou em outras células difíceis de transfeito e produzir ferramentas valiosas para estudar esses genes em células humanas.
Introduction
Com o progresso do sequenciamento genético e a identificação de mutações em genes de funções desconhecidas em um tecido específico, o desenvolvimento de modelos celulares relevantes para entender a função de um novo gene alvo e confirmar seu envolvimento nos mecanismos fisiodicos relacionados constitui uma ferramenta essencial. Além disso, esses modelos são de grande importância para futuros desenvolvimentos terapêuticos 1,2, constituindo uma alternativa interessante para o desenvolvimento de modelos animais nocautes em linha reta com as recomendações internacionais para redução do uso de animais na experimentação. A edição de genes usando CRISPR/Cas9 está entre as ferramentas mais poderosas disponíveis atualmente, o que permitiu o desenvolvimento de muitos modelos knock-out/knock-in, e a validação de genes direcionada usando CRISPR/Cas9 está entre as aplicações mais utilizadas do CRISPR/Cas93. O sucesso da edição de genes baseia-se na capacidade de introduzir as ferramentas CRISPR (o guia RNAs e o nuclease Cas9) no modelo de célula alvo, o que pode ser um desafio em muitas células difíceis de transfectar, como as células musculares4. Esse desafio pode ser superado com o uso do vírus, geralmente o lentivírus, que tem a grande vantagem de transduzir eficientemente muitos tipos de células e entregar seu transgene. Mas sua maior desvantagem é a integração do transgene no genoma da célula hospedeira, levando a uma possível alteração de genes localizados no local de integração e à expressão permanente do transgene, o que no caso do nuclease Cas9 resultaria em consequências prejudiciais5. Uma solução inteligente foi proposta por Merienne e seus colegas6, que consiste em introdução nas células de um guia-RNA visando o próprio gene Cas9, levando à inativação cas9. Uma adaptação dessa estratégia é apresentada aqui como um protocolo fácil de usar e versátil, permitindo eliminar praticamente qualquer gene em células difíceis de transfetar.
O objetivo do protocolo aqui apresentado é induzir a inativação de um gene de interesse em células musculares imortalizadas. Pode ser usado para eliminar qualquer gene de interesse.em diferentes tipos de células imortalizadas. O protocolo descrito aqui contém etapas para projetar os RNAs guia e sua clonagem em plasmídeos lentiviral, para produzir as ferramentas CRISPR em vetores lentivirais, para transdutar as células com os diferentes lentivírus, e para clonar as células para produzir uma linha celular homogênea editada.
Usando este protocolo, células musculares esqueléticas humanas imortalizadas foram desenvolvidas com a exclusão do receptor ryanodine tipo 1 (RyR1), um canal essencial de cálcio envolvido na liberação intracelular de cálcio e contração muscular7. O knock-out (KO) do gene foi confirmado no nível de proteína usando a mancha ocidental, e no nível funcional usando imagens de cálcio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um grande passo no caminho para a caracterização de genes de função desconhecida envolvidos em patologias é o desenvolvimento de modelos celulares relevantes para estudar a função desses genes. O uso da edição de genes usando CRISPR/Cas9 é um campo de pesquisa em crescimento exponencial, e o desenvolvimento de modelos de knock-out como apresentado aqui está entre suas aplicações mais utilizadas. Nesse contexto, propomos aqui um protocolo versátil para desenvolver uma linha celular humana em qualquer gene de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por subsídios da Associação Francesa contre les myopathies (AFM-Téléthon) e da Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).
Materials
| Anti-CACNA1S antibody | Sigma-Aldrich | HPA048892 | Primary antibody |
| Blp I | NE BioLabs | R0585S | Restriction enzyme |
| CalPhos Mammalian Transfection Kit | Takara | 631312 | Transfection kit |
| Easy blot anti Mouse IgG | GeneTex | GTX221667-01 | HRP secondary antibody |
| Easy blot anti Rabbit IgG | GeneTex | GTX221666 | HRP secondary antibody |
| Fluo-4 direct | Molecular Probes | F10472 | Calcium imaging |
| GAPDH(14C10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #2118 | Primary antibody |
| HindIII | Fermentas | ER0501 | Restriction enzyme |
| InFusion HD Precision Plus | Takara | 638920 | Ligation kit |
| MasterMix Phusion High Fidelity with GC | ThermoFisher Scientific | F532L | Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs |
| Myosin Heavy Chain antibody | DHSB | MF20 | Primary antibody |
| NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | REF 740424 | Maxipreparation kit for purification of plasmids |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609 | DNA purification |
| NucleoSpin Tissue | Macherey-Nagel | 740952 | Kit for DNA extraction from cell |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C737303 | Chemically competent cells |
| Plasmid #87904 | Addgene | 87904 | Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9) |
| Plasmid #87919 | Addgene | 87919 | Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target) |
| Plasmid #12260 | Addgene | 12260 | Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL |
| Plasmid #8454 | Addgene | 8454 | Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
| V5 Tag Monoclonal Antibody | Invitrogene | R96025 | Primary antibody |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | Chemically competent cells |
| Xma I | NE BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
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