פיתוח קווי תאי שריר נוק-אאוט באמצעות עריכת גנים של קריספר/Cas9 בתיווך נגיף לנטי
Summary
הפרוטוקול מתאר כיצד ליצור מיובלסטים נוק-אאוט באמצעות CRISPR/Cas9, החל מתכנון של רנ”א מנחים ועד לשיבוט תאי ואפיון של שיבוטים נוק-אאוט.
Abstract
יישום חשוב אחד של חזרות פלינדרומיות קצרות (CRISPR)/Cas 9 הוא פיתוח של קווי תאים נוק-אאוט, במיוחד כדי לחקור את תפקודם של גנים/חלבונים חדשים הקשורים למחלה, שזוהו במהלך האבחון הגנטי. לצורך פיתוח קווי תאים כאלה, יש להתיר שתי סוגיות עיקריות: החדרת כלי הקריספר (ה-Cas9 וה-RNA המנחה) ביעילות גבוהה לתאים שנבחרו, והגבלת פעילות ה-Cas9 למחיקה הספציפית של הגן הנבחר. הפרוטוקול המתואר כאן מוקדש להחדרת כלי הקריספר בתאים קשים להעברה, כגון תאי שריר. פרוטוקול זה מבוסס על שימוש ב- lentiviruses, המיוצרים עם פלסמידים הזמינים לציבור, שעבורם מתוארים כל שלבי השיבוט כדי להתמקד בגן בעל עניין. הבקרה על פעילות Cas9 בוצעה באמצעות התאמה של מערכת שתוארה בעבר בשם KamiCas9, שבה התמרת התאים עם נגיף לנטי המקודד RNA מנחה המכוון ל- Cas9 מאפשרת ביטול הדרגתי של ביטוי Cas9. פרוטוקול זה יושם על פיתוח קו תאי שריר אנושיים RYR1-knock out, אשר אופיין עוד יותר ברמת החלבון והתפקוד, כדי לאשר את הנוקאאוט של תעלת סידן חשובה זו המעורבת בשחרור סידן תוך תאי בשרירים ובצימוד עירור-התכווצות. ההליך המתואר כאן יכול בקלות להיות מיושם על גנים אחרים בתאי שריר או בתאים אחרים שקשה להעבירם ולייצר כלים חשובים לחקר גנים אלה בתאים אנושיים.
Introduction
עם התקדמות ריצוף הגנים וזיהוי מוטציות בגנים בעלי תפקודים לא ידועים ברקמה מסוימת, פיתוח מודלים תאיים רלוונטיים להבנת תפקודו של גן מטרה חדש ולאישור מעורבותו במנגנונים הפתופיזיולוגיים הקשורים מהווה כלי חיוני. בנוסף, מודלים אלה הם בעלי חשיבות עליונה לפיתוחים טיפוליים עתידיים 1,2, ומהווים חלופה מעניינת לפיתוח מודלים של בעלי חיים נוק-אאוט בקו ישר עם ההמלצות הבינלאומיות לצמצום השימוש בבעלי חיים בניסויים. עריכת גנים באמצעות CRISPR/Cas9 היא בין הכלים החזקים ביותר הקיימים כיום, מה שאיפשר פיתוח של מודלים רבים של נוק-אאוט/נוק-אין, ואימות גנים ממוקד באמצעות CRISPR/Cas9 הוא בין היישומים הנפוצים ביותר של CRISPR/Cas93. ההצלחה של עריכת גנים נשענת על היכולת להכניס את כלי הקריספר (הרנ”א המנחים והנוקלאז Cas9) במודל תאי המטרה, מה שיכול להוות אתגר בתאים רבים שקשה לבצע טרנספקט, כגון תאי שריר4. ניתן להתגבר על אתגר זה באמצעות שימוש בנגיף, בדרך כלל lentivirus, שיש לו את היתרון הגדול להתמר ביעילות סוגי תאים רבים ולספק את הטרנסג’ן שלו. אבל החיסרון העיקרי שלה הוא השילוב של הטרנסגן בגנום של התא המארח, מה שמוביל לשינוי פוטנציאלי של גנים הממוקמים באתר האינטגרציה ולביטוי הקבוע של הטרנסגן, שבמקרה של הנוקלאז Cas9 יגרום לתוצאות מזיקות5. פתרון חכם הוצע על ידי מריאן ועמיתיו6, המורכב מהכנסה לתאים של רנ”א מנחה המכוון לגן Cas9 עצמו, מה שמוביל להשבתת Cas9. התאמה של אסטרטגיה זו מוצגת כאן כפרוטוקול ידידותי למשתמש ורב-תכליתי המאפשר לדפוק כמעט כל גן בתאים קשים להעברה.
מטרת הפרוטוקול המוצג כאן היא לגרום להשבתה של גן בעל עניין בתאי שריר מונצחים. ניתן להשתמש בו כדי להפיל כל גן בעל עניין, בסוגים שונים של תאים מונצחים. הפרוטוקול המתואר כאן מכיל שלבים לתכנון הרנ”א המנחים ושיבוטם לפלסמידים לנטי-ויראליים, לייצור כלי הקריספר בווקטורים לנטי-ויראליים, להתמרת התאים עם נגיפי הלנטי-וירוסים השונים, ולשיבוט התאים כדי לייצר קו תאים ערוך הומוגני.
באמצעות פרוטוקול זה, פותחו תאי שרירי שלד אנושיים מונצחים עם מחיקה של קולטן ריאנודין מסוג 1 (RyR1), תעלת סידן חיונית המעורבת בשחרור סידן תוך תאי ובהתכווצות שרירים7. הנוק-אאוט (KO) של הגן אושר ברמת החלבון באמצעות כתם מערבי, וברמה התפקודית באמצעות הדמיית סידן.
Protocol
Representative Results
Discussion
צעד מרכזי בדרך לאפיון גנים בעלי תפקוד לא ידוע המעורבים בפתולוגיות הוא פיתוח מודלים תאיים רלוונטיים לחקר תפקודם של גנים אלה. השימוש בעריכת גנים באמצעות CRISPR/Cas9 הוא תחום מחקר הולך וגדל באופן אקספוננציאלי, ופיתוח מודלים של נוק-אאוט כפי שהוצגו כאן הוא בין היישומים הנפוצים ביותר שלו. בהקשר זה, א…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מענקים מטעם האגודה הצרפתית contre les myopathies (AFM-Téléthon) ומ-Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).
Materials
| Anti-CACNA1S antibody | Sigma-Aldrich | HPA048892 | Primary antibody |
| Blp I | NE BioLabs | R0585S | Restriction enzyme |
| CalPhos Mammalian Transfection Kit | Takara | 631312 | Transfection kit |
| Easy blot anti Mouse IgG | GeneTex | GTX221667-01 | HRP secondary antibody |
| Easy blot anti Rabbit IgG | GeneTex | GTX221666 | HRP secondary antibody |
| Fluo-4 direct | Molecular Probes | F10472 | Calcium imaging |
| GAPDH(14C10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #2118 | Primary antibody |
| HindIII | Fermentas | ER0501 | Restriction enzyme |
| InFusion HD Precision Plus | Takara | 638920 | Ligation kit |
| MasterMix Phusion High Fidelity with GC | ThermoFisher Scientific | F532L | Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs |
| Myosin Heavy Chain antibody | DHSB | MF20 | Primary antibody |
| NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | REF 740424 | Maxipreparation kit for purification of plasmids |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609 | DNA purification |
| NucleoSpin Tissue | Macherey-Nagel | 740952 | Kit for DNA extraction from cell |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C737303 | Chemically competent cells |
| Plasmid #87904 | Addgene | 87904 | Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9) |
| Plasmid #87919 | Addgene | 87919 | Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target) |
| Plasmid #12260 | Addgene | 12260 | Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL |
| Plasmid #8454 | Addgene | 8454 | Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
| V5 Tag Monoclonal Antibody | Invitrogene | R96025 | Primary antibody |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | Chemically competent cells |
| Xma I | NE BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
- Claussnitzer, M., Susztak, K. Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries. Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).
- Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G. Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies. Genes. 11 (5), 473 (2020).
- Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications. Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).
- Olson, E. N. Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).
- Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. Target specificity of the CRISPR-Cas9 system. Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).
- Merienne, N., et al. The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes. Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).
- Marty, I., Fauré, J. Excitation-contraction coupling alterations in myopathies. Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
- Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers. The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).
- Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. A linear Lowry–Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins. Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).
- Garibaldi, M., et al. Dusty core disease’ (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3 (2019).
- Marty, I., et al. Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).
- Oddoux, S., et al. Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1, 34 (2011).
- Cacheux, M., et al. Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein. Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).
- Luis, A. The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology. Viruses. 12 (10), 1103 (2020).
- Leenay, R. T., Beisel, C. L. Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM. Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Neurosciences. , (2006).
