Een stabiel gevestigde tweepuntsinjectie van lysofosfatidylcholine-geïnduceerd focale demyelinisatiemodel bij muizen
Summary
Het huidige protocol beschrijft een tweepuntsinjectie van lysofosfatidylcholine via een stereotaxisch frame om een stabiel en reproduceerbaar demyelinisatiemodel bij muizen te genereren.
Abstract
Receptorgemedieerde lysofosfolipidensignalering draagt bij aan de pathofysiologie van diverse neurologische ziekten, met name multiple sclerose (MS). Lysophosphatidylcholine (LPC) is een endogene lysofosfolipide geassocieerd met ontsteking, en het kan snelle schade veroorzaken met toxiciteit voor myeline lipiden, wat leidt tot focale demyelinisatie. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor stereotactische tweepunts LPC-injectie die direct ernstige demyelinisatie kan veroorzaken en de experimentele demyelinisatiebeschadiging snel en stabiel bij muizen kan repliceren door chirurgische ingreep. Dit model is dus zeer relevant voor demyelinisatieziekten, met name MS, en het kan bijdragen aan het gerelateerde voortschrijdende klinisch relevante onderzoek. Ook werden immunofluorescentie en Luxol snelle blauwe kleuringsmethoden gebruikt om het tijdsverloop van demyelinisatie in het corpus callosum van muizen geïnjecteerd met LPC weer te geven. Daarnaast werd de gedragsmethode gebruikt om de cognitieve functie van muizen na modellering te evalueren. Over het algemeen is de tweepuntsinjectie van lysofosfatidylcholine via een stereotaxisch frame een stabiele en reproduceerbare methode om een demyelinisatiemodel bij muizen te genereren voor verder onderzoek.
Introduction
Receptorgemedieerde lysofosfolipide signalering omvat diverse fysiologische processen van bijna alle orgaansystemen1. In het centrale zenuwstelsel (CZS) speelt deze signalering een cruciale rol bij de pathogenieën van auto-immuun neurologische ziekten zoals multiple sclerose (MS). Multiple sclerose is een chronische immuungemedieerde aandoening die wordt gekenmerkt door pathologische demyelinisatie en ontstekingsreactie, waardoor neurologische disfunctie en cognitieve stoornissen ontstaan 2,3. Na continue terugval en remitting tijdens de vroege ziekte, gaan de meeste patiënten uiteindelijk door naar het secundair-progressieve stadium, wat onomkeerbare schade aan de hersenen en de daaruit voortvloeiende invaliditeit kan veroorzaken4. Er wordt aangenomen dat het pathologische kenmerk van het secundair-progressieve beloop het demyeliniseren van plaques veroorzaakt door inflammatoire laesiesis 5. Bestaande behandelingen voor MS kunnen het risico op terugval aanzienlijk verminderen. Er is echter nog steeds geen effectieve therapie voor langdurige demyeliniserende schade veroorzaakt door progressieve MS6. Er is dus een stabiel en gemakkelijk reproduceerbaar model nodig om preklinische therapieën te bestuderen die zich richten op degeneratie van witte stof.
Demyelinisatie en remyelinisatie zijn twee belangrijke pathologische processen bij het ontwikkelen van multiple sclerose. Demyelinisatie is het verlies van myelineschede rond axonen geïnduceerd door microglia met pro-inflammatoire fenotypen7, en het leidt tot langzame geleiding van zenuwimpulsen en resulteert in het verlies van neuronen en neurologische aandoeningen. Remyelinisatie is een endogene reparatierespons gemedieerd door oligodendrocyten, waarbij aandoeningen kunnen leiden tot neurodegeneratie en cognitieve stoornissen8. De ontstekingsreactie is cruciaal voor het hele proces en beïnvloedt zowel de mate van myelineschade als het herstel.
Daarom is een stabiel diermodel van aanhoudende inflammatoire demyelinisatie zinvol voor verdere verkenning van therapeutische strategieën voor MS. Vanwege de complexiteit van MS zijn verschillende soorten diermodellen opgesteld om demyeliniserende laesies in vivo na te bootsen, waaronder experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE), toxisch-demyeliniserende modellen, cuprizon (CPZ) en lysofosfosfatidylcholine (LPC)9 . LPC is een endogene lysofosfolipide geassocieerd met ontsteking, en het kan snelle schade veroorzaken met toxiciteit voor myeline lipiden, wat leidt tot focale demyelinisatie. Op basis van eerdere rapporten en onderzoek10,11 wordt een gedetailleerd protocol van tweepuntsinjectie met enkele wijzigingen verstrekt. Over het algemeen produceert het klassieke eenpunts LPC-injectiemodel alleen lokale demyelinisatie op de injectieplaats en gaat het vaak gepaard met spontane remyelinisatie12,13. Het tweepuntsinjectie LPC-model kan echter aantonen dat de LPC direct demyelinisatie in het corpus callosum van de muis kan induceren en duurzamere demyelinisatie kan veroorzaken met weinig myelineregeneratie.
Protocol
Representative Results
Discussion
MS, een chronische demyeliniserende ziekte van het CZS, is een van de meest voorkomende oorzaken van neurologische disfunctie bij jonge volwassenen20. Klinisch ervaren ongeveer 60%-80% van de MS-patiënten de cyclus van recidieven en remissies voordat ze een secundair progressieve MS21,22 ontwikkelen, en het leidt uiteindelijk tot cumulatieve bewegingsstoornissen en cognitieve tekorten in de loop van de tijd23. Mome…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grants: 82071380, 81873743).
Materials
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
References
- Gaire, B. P., Choi, J. W. Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864 (2021).
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis – a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Mahad, D. H., Trapp, B. D., Lassmann, H. Pathological mechanisms in progressive multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 14 (2), 183-193 (2015).
- Filippi, M., et al. Multiple sclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 43 (2018).
- Villoslada, P., Steinman, L. New targets and therapeutics for neuroprotection, remyelination and repair in multiple sclerosis. Expert Opinion on Investigational Drugs. 29 (5), 443-459 (2020).
- Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936 (2018).
- Franklin, R. J., Ffrench-Constant, C. Remyelination in the CNS: From biology to therapy. Nature Reviews Neuroscience. 9 (11), 839-855 (2008).
- Gentile, A., et al. Immunomodulatory effects of exercise in experimental multiple sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2197 (2019).
- Chen, M., et al. Deficiency of microglial Hv1 channel is associated with activation of autophagic pathway and ROS production in LPC-induced demyelination mouse model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 333 (2020).
- Luo, Q., et al. A stable and easily reproducible model of focal white matter demyelination. Journal of Neuroscience Methods. 307, 230-239 (2018).
- Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination in experimental models of toxin-induced demyelination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 318, 193-212 (2008).
- Degaonkar, M. N., Raghunathan, P., Jayasundar, R., Jagannathan, N. R. Determination of relaxation characteristics during preacute stage of lysophosphatidyl choline-induced demyelinating lesion in rat brain: An animal model of multiple sclerosis. Magnetic Resonance Imaging. 23 (1), 69-73 (2005).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Plemel, J. R., et al. Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy. Glia. 66 (2), 327-347 (2018).
- Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Developmental Biology. 302 (2), 683-693 (2007).
- Kassis, H., et al. Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke. Neurochemistry International. 77, 17-23 (2014).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, 1972-1983 (2006).
- Karussis, D. The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review. Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).
- Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45 (2022).
- Kutzelnigg, A., et al. Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis. Brain. 128, 2705-2712 (2005).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality). Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).
- Lamport, A. C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum. Journal of Neuroimmunology. 334, 576995 (2019).
- Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. The cuprizone model for demyelination. Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum. 188, 72-76 (2008).
- Zhan, J., et al. The cuprizone model: Dos and do nots. Cells. 9 (4), 843 (2020).
- Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia (Barcelona, Spain). 35 (1), 32-39 (2020).
- Merkler, D., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset reflects the immunopathology of pattern II multiple sclerosis lesions. Multiple Sclerosis Journal. 12 (4), 369-374 (2006).
- Ucal, M., et al. Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats. Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).
