Una inyección de dos puntos establecida de manera estable de modelo de desmielinización focal inducida por lisofosfatidilcolina en ratones
Summary
El presente protocolo describe una inyección de dos puntos de lisofosfatidilcolina a través de un marco estereotáxico para generar un modelo de desmielinización estable y reproducible en ratones.
Abstract
La señalización de lisofosfolípidos mediada por receptores contribuye a la fisiopatología de diversas enfermedades neurológicas, especialmente la esclerosis múltiple (EM). La lisofosfatidilcolina (LPC) es un lisofosfolípido endógeno asociado con la inflamación, y podría inducir un daño rápido con toxicidad a los lípidos de mielina, lo que lleva a la desmielinización focal. Aquí, se presenta un protocolo detallado para la inyección estereotáctica de LPC de dos puntos que podría causar directamente una desmielinización severa y replicar la lesión experimental de desmielinización de forma rápida y estable en ratones mediante procedimiento quirúrgico. Por lo tanto, este modelo es altamente relevante para las enfermedades de desmielinización, especialmente la EM, y puede contribuir al avance relacionado de la investigación clínicamente relevante. Además, se utilizaron métodos de inmunofluorescencia y tinción azul rápida Luxol para representar el curso temporal de la desmielinización en el cuerpo calloso de ratones inyectados con LPC. Además, se utilizó el método conductual para evaluar la función cognitiva de los ratones después del modelado. En general, la inyección de dos puntos de lisofosfatidilcolina a través de un marco estereotáxico es un método estable y reproducible para generar un modelo de desmielinización en ratones para su posterior estudio.
Introduction
La señalización de lisofosfolípidos mediada por receptores implica diversos procesos fisiológicos de casi todos los sistemas de órganos1. En el sistema nervioso central (SNC), esta señalización juega un papel crítico en las patogenicidades de enfermedades neurológicas autoinmunes como la esclerosis múltiple (EM). La esclerosis múltiple es un trastorno crónico inmunomediado caracterizado por desmielinización patológica y respuesta inflamatoria, causando disfunción neurológica y deterioro cognitivo 2,3. Después de continuas recaídas y remisiones durante la enfermedad temprana, la mayoría de los pacientes eventualmente progresan a la etapa secundaria-progresiva, lo que podría causar daños irreversibles en el cerebro y la discapacidad resultante4. Se cree que el sello patológico del curso secundario-progresivo son las placas desmielinizantes causadas por lesiones inflamatorias5. Los tratamientos existentes para la EM pueden reducir significativamente el riesgo de recaída. Sin embargo, todavía no existe una terapia efectiva para el daño desmielinizante a largo plazo causado por la EMprogresiva 6. Por lo tanto, se requiere un modelo estable y fácilmente reproducible para estudiar terapias preclínicas que se centren en la degeneración de la materia blanca.
La desmielinización y la remielinización son dos procesos patológicos principales en el desarrollo de la esclerosis múltiple. La desmielinización es la pérdida de vaina de mielina alrededor de los axones inducida por la microglía con fenotipos proinflamatorios7, y conduce a una conducción lenta de los impulsos nerviosos y resulta en la pérdida de neuronas y trastornos neurológicos. La remielinización es una respuesta de reparación endógena mediada por oligodendrocitos, donde los trastornos podrían conducir a la neurodegeneración y al deterioro cognitivo8. La respuesta inflamatoria es crucial para todo el proceso, afectando tanto el grado de daño como la reparación de la mielina.
Por lo tanto, un modelo animal estable de desmielinización inflamatoria persistente es significativo para una mayor exploración de estrategias terapéuticas para la EM. Debido a la complejidad de la EM, se han establecido varios tipos de modelos animales para imitar lesiones desmielinizantes in vivo, incluida la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), modelos tóxico-desmielinizantes, cuprizona (CPZ) y lisofosfatidilcolina (LPC)9 . LPC es un lisofosfolípido endógeno asociado con la inflamación, y podría inducir un daño rápido con toxicidad a los lípidos de mielina, lo que lleva a la desmielinización focal. Sobre la base de informes previos einvestigaciones 10,11, se proporciona un protocolo detallado de inyección de dos puntos con algunas modificaciones. Generalmente, el modelo clásico de inyección de LPC de un punto solo produce desmielinización local en el sitio de inyección y a menudo se acompaña de remielinización espontánea12,13. Sin embargo, el modelo LPC de inyección de dos puntos puede demostrar que el LPC puede inducir directamente la desmielinización en el cuerpo calloso del ratón y causar una desmielinización más duradera con poca regeneración de mielina.
Protocol
Representative Results
Discussion
La EM, una enfermedad desmielinizante crónica del SNC, es una de las causas más comunes de disfunción neurológica en adultos jóvenes20. Clínicamente, aproximadamente el 60%-80% de los pacientes con EM experimentan el ciclo de recaídas y remisiones antes de desarrollar una EM secundaria-progresiva21,22, y eventualmente conduce a deficiencias acumulativas del movimiento y déficits cognitivos a lo largo del tiempo23<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvenciones: 82071380, 81873743).
Materials
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
References
- Gaire, B. P., Choi, J. W. Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864 (2021).
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis – a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Mahad, D. H., Trapp, B. D., Lassmann, H. Pathological mechanisms in progressive multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 14 (2), 183-193 (2015).
- Filippi, M., et al. Multiple sclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 43 (2018).
- Villoslada, P., Steinman, L. New targets and therapeutics for neuroprotection, remyelination and repair in multiple sclerosis. Expert Opinion on Investigational Drugs. 29 (5), 443-459 (2020).
- Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936 (2018).
- Franklin, R. J., Ffrench-Constant, C. Remyelination in the CNS: From biology to therapy. Nature Reviews Neuroscience. 9 (11), 839-855 (2008).
- Gentile, A., et al. Immunomodulatory effects of exercise in experimental multiple sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2197 (2019).
- Chen, M., et al. Deficiency of microglial Hv1 channel is associated with activation of autophagic pathway and ROS production in LPC-induced demyelination mouse model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 333 (2020).
- Luo, Q., et al. A stable and easily reproducible model of focal white matter demyelination. Journal of Neuroscience Methods. 307, 230-239 (2018).
- Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination in experimental models of toxin-induced demyelination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 318, 193-212 (2008).
- Degaonkar, M. N., Raghunathan, P., Jayasundar, R., Jagannathan, N. R. Determination of relaxation characteristics during preacute stage of lysophosphatidyl choline-induced demyelinating lesion in rat brain: An animal model of multiple sclerosis. Magnetic Resonance Imaging. 23 (1), 69-73 (2005).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Plemel, J. R., et al. Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy. Glia. 66 (2), 327-347 (2018).
- Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Developmental Biology. 302 (2), 683-693 (2007).
- Kassis, H., et al. Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke. Neurochemistry International. 77, 17-23 (2014).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, 1972-1983 (2006).
- Karussis, D. The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review. Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).
- Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45 (2022).
- Kutzelnigg, A., et al. Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis. Brain. 128, 2705-2712 (2005).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality). Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).
- Lamport, A. C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum. Journal of Neuroimmunology. 334, 576995 (2019).
- Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. The cuprizone model for demyelination. Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum. 188, 72-76 (2008).
- Zhan, J., et al. The cuprizone model: Dos and do nots. Cells. 9 (4), 843 (2020).
- Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia (Barcelona, Spain). 35 (1), 32-39 (2020).
- Merkler, D., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset reflects the immunopathology of pattern II multiple sclerosis lesions. Multiple Sclerosis Journal. 12 (4), 369-374 (2006).
- Ucal, M., et al. Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats. Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).
