Un'iniezione a due punti stabilmente stabilita del modello di demielinizzazione focale indotta da lisofosfatidilcolina nei topi
Summary
Il presente protocollo descrive un’iniezione a due punti di lisofosfatidilcolina attraverso un frame stereotassico per generare un modello di demielinizzazione stabile e riproducibile nei topi.
Abstract
La segnalazione dei lisofosfolipidi mediata dal recettore contribuisce alla fisiopatologia di diverse malattie neurologiche, in particolare la sclerosi multipla (SM). La lisofosfatidilcolina (LPC) è un lisofosfolipide endogeno associato all’infiammazione e potrebbe indurre un rapido danno con tossicità ai lipidi mielinici, portando alla demielinizzazione focale. Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per l’iniezione stereotassica di LPC a due punti che potrebbe causare direttamente una grave demielinizzazione e replicare la lesione da demielinizzazione sperimentale in modo rapido e stabile nei topi mediante procedura chirurgica. Pertanto, questo modello è molto rilevante per le malattie da demielinizzazione, in particolare la SM, e può contribuire al relativo avanzamento della ricerca clinicamente rilevante. Inoltre, l’immunofluorescenza e i metodi di colorazione blu veloce Luxol sono stati utilizzati per rappresentare il decorso temporale della demielinizzazione nel corpo calloso dei topi iniettati con LPC. Inoltre, il metodo comportamentale è stato utilizzato per valutare la funzione cognitiva dei topi dopo la modellazione. Nel complesso, l’iniezione a due punti di lisofosfatidilcolina attraverso un frame stereotassico è un metodo stabile e riproducibile per generare un modello di demielinizzazione nei topi per ulteriori studi.
Introduction
La segnalazione dei lisofosfolipidi mediata dal recettore coinvolge diversi processi fisiologici di quasi tutti i sistemi di organi1. Nel sistema nervoso centrale (SNC), questa segnalazione svolge un ruolo fondamentale nella patogenetà delle malattie neurologiche autoimmuni come la sclerosi multipla (SM). La sclerosi multipla è una malattia cronica immuno-mediata caratterizzata da demielinizzazione patologica e risposta infiammatoria, che causa disfunzione neurologica e deterioramento cognitivo 2,3. Dopo continue recidive e remittenti durante la malattia precoce, la maggior parte dei pazienti alla fine progredisce allo stadio secondario-progressivo, che potrebbe causare danni irreversibili al cervello e conseguente disabilità4. Si ritiene che il segno patologico del decorso secondario-progressivo sia la demielinizzazione delle placche causate da lesioni infiammatorie5. I trattamenti esistenti per la SM possono ridurre significativamente il rischio di recidiva. Tuttavia, non esiste ancora una terapia efficace per il danno demielinizzante a lungo termine causato dalla SM6 progressiva. Pertanto, è necessario un modello stabilmente stabilito e facilmente riproducibile per studiare terapie precliniche che si concentrano sulla degenerazione della sostanza bianca.
La demielinizzazione e la rimielinizzazione sono due importanti processi patologici nello sviluppo della sclerosi multipla. La demielinizzazione è la perdita della guaina mielinica intorno agli assoni indotta da microglia con fenotipi pro-infiammatori7, e porta a una lenta conduzione degli impulsi nervosi e provoca la perdita di neuroni e disturbi neurologici. La rimielinizzazione è una risposta di riparazione endogena mediata da oligodendrociti, in cui i disturbi potrebbero portare a neurodegenerazione e deterioramento cognitivo8. La risposta infiammatoria è cruciale per l’intero processo, influenzando sia il grado di danno mielinico che la riparazione.
Pertanto, un modello animale stabile di demielinizzazione infiammatoria persistente è significativo per un’ulteriore esplorazione delle strategie terapeutiche per la SM. A causa della complessità della SM, sono stati stabiliti vari tipi di modelli animali per imitare le lesioni demielinizzanti in vivo, tra cui l’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), i modelli tossico-demielinizzanti, il cuprizone (CPZ) e la lisofosfatidilcolina (LPC)9 . LPC è un lisofosfolipide endogeno associato all’infiammazione e potrebbe indurre un rapido danno con tossicità ai lipidi mielinici, portando alla demielinizzazione focale. Sulla base di precedenti rapporti e ricerche10,11, viene fornito un protocollo dettagliato di iniezione a due punti con alcune modifiche. Generalmente, il classico modello di iniezione LPC a un punto produce solo demielinizzazione locale nel sito di iniezione ed è spesso accompagnato da rimielinizzazione spontanea12,13. Tuttavia, il modello LPC a iniezione a due punti può dimostrare che l’LPC può indurre direttamente demielinizzazione nel corpo calloso del topo e causare demielinizzazione più duratura con poca rigenerazione della mielina.
Protocol
Representative Results
Discussion
La SM, una malattia demielinizzante cronica del SNC, è una delle cause più comuni di disfunzione neurologica nei giovani adulti20. Clinicamente, circa il 60%-80% dei pazienti con SM sperimenta il ciclo di recidive e remissioni prima di sviluppare una SM21,22 secondaria-progressiva, e alla fine porta a disturbi cumulativi del movimento e deficit cognitivi nel tempo23. Attualmente, nessun singolo modello sperimental…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Sovvenzioni: 82071380, 81873743).
Materials
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
References
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