Ein stabil etabliertes Zwei-Punkt-Injektionsmodell für Lysophosphatidylcholin-induziertes fokales Demyelin-Modell bei Mäusen
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Zwei-Punkt-Injektion von Lysophosphatidylcholin über einen stereotaktischen Rahmen, um ein stabiles und reproduzierbares Demyelinmodell in Mäusen zu erzeugen.
Abstract
Die rezeptorvermittelte Lysophospholipid-Signalgebung trägt zur Pathophysiologie verschiedener neurologischer Erkrankungen, insbesondere der Multiplen Sklerose (MS), bei. Lysophosphatidylcholin (LPC) ist ein endogenes Lysophospholipid, das mit Entzündungen assoziiert ist, und es könnte eine schnelle Schädigung mit Toxizität für Myelinlipide induzieren, was zu einer fokalen Demyelinisierung führt. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die stereotaktische Zwei-Punkt-LPC-Injektion vorgestellt, die eine schwere Demyelinisierung direkt verursachen und die experimentelle Demyelinisierungsverletzung bei Mäusen durch chirurgische Eingriffe schnell und stabil replizieren könnte. Somit ist dieses Modell für Demyelinisierungserkrankungen, insbesondere MS, von hoher Relevanz und kann dazu beitragen, die damit verbundene klinisch relevante Forschung voranzutreiben. Auch Immunfluoreszenz- und Luxol-Schnellblaufärbungsmethoden wurden verwendet, um den zeitlichen Verlauf der Demyelinisierung im Corpus callosum von Mäusen, denen LPC injiziert wurde, darzustellen. Darüber hinaus wurde die Verhaltensmethode verwendet, um die kognitive Funktion von Mäusen nach der Modellierung zu bewerten. Insgesamt ist die Zwei-Punkt-Injektion von Lysophosphatidylcholin über einen stereotaktischen Rahmen eine stabile und reproduzierbare Methode, um ein Demyelinisierungsmodell in Mäusen für weitere Studien zu generieren.
Introduction
Die rezeptorvermittelte Lysophospholipid-Signalgebung umfasst verschiedene physiologische Prozesse fast aller Organsysteme1. Im zentralen Nervensystem (ZNS) spielt diese Signalübertragung eine entscheidende Rolle bei den Erregern autoimmuner neurologischer Erkrankungen wie der Multiplen Sklerose (MS). Multiple Sklerose ist eine chronische immunvermittelte Erkrankung, die durch pathologische Demyelinisierung und Entzündungsreaktion gekennzeichnet ist und neurologische Dysfunktion und kognitive Beeinträchtigung verursacht 2,3. Nach kontinuierlichem Rezidiv und Remittieren während der frühen Erkrankung gelangen die meisten Patienten schließlich in das sekundär-progressive Stadium, das irreversible Schäden am Gehirn und eine daraus resultierende Behinderung verursachen kann4. Es wird angenommen, dass das pathologische Kennzeichen des sekundär-progressiven Verlaufs demyelinisierende Plaques sind, die durch entzündliche Läsionen verursacht werden5. Bestehende Behandlungen für MS können das Risiko eines Rückfalls signifikant reduzieren. Es gibt jedoch immer noch keine wirksame Therapie für langfristige demyelinisierende Schäden, die durch progressive MS6 verursacht werden. Daher ist ein stabil etabliertes und leicht reproduzierbares Modell erforderlich, um präklinische Therapeutika zu untersuchen, die sich auf die Degeneration der weißen Substanz konzentrieren.
Demyelinisierung und Remyelinisierung sind zwei wichtige pathologische Prozesse bei der Entwicklung von Multipler Sklerose. Demyelinisierung ist der Verlust von Myelinscheide um Axone, die durch Mikroglia mit proinflammatorischen Phänotypen7 induziert werden, und es führt zu einer langsamen Leitung von Nervenimpulsen und führt zum Verlust von Neuronen und neurologischen Störungen. Remyelinisierung ist eine endogene Reparaturreaktion, die durch Oligodendrozyten vermittelt wird, wo Störungen zu Neurodegeneration und kognitiven Beeinträchtigungen führen können8. Die Entzündungsreaktion ist entscheidend für den gesamten Prozess und beeinflusst sowohl den Grad der Myelinschädigung als auch die Reparatur.
Daher ist ein stabiles Tiermodell der persistierenden entzündlichen Demyelinisierung für die weitere Erforschung therapeutischer Strategien für MS von Bedeutung. Aufgrund der Komplexität von MS wurden verschiedene Arten von Tiermodellen etabliert, um demyelinisierende Läsionen in vivo nachzuahmen, einschließlich experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE), toxisch-demyelinisierender Modelle, Cuprizon (CPZ) und Lysophosphatidylcholin (LPC)9 . LPC ist ein endogenes Lysophospholipid, das mit Entzündungen assoziiert ist, und es könnte schnelle Schäden mit Toxizität für Myelinlipide induzieren, was zu einer fokalen Demyelinisierung führt. Basierend auf früheren Berichten und Forschungsergebnissen10,11 wird ein detailliertes Protokoll der Zweipunktinjektion mit einigen Modifikationen bereitgestellt. Im Allgemeinen erzeugt das klassische Einpunkt-LPC-Injektionsmodell nur eine lokale Demyelinisierung an der Injektionsstelle und wird oft von einer spontanen Remyelinisierungbegleitet 12,13. Das Zwei-Punkt-Injektions-LPC-Modell kann jedoch zeigen, dass der LPC eine Demyelinisierung im Mouse Corpus callosum direkt induzieren und eine dauerhaftere Demyelinisierung mit geringer Myelinregeneration verursachen kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
MS, eine chronisch demyelinisierende Erkrankung des ZNS, ist eine der häufigsten Ursachen für neurologische Funktionsstörungen bei jungen Erwachsenen20 Jahren. Klinisch erleben etwa 60%-80% der MS-Patienten den Zyklus von Rückfällen und Remissionen, bevor sie eine sekundär-progrediente MS 21,22 entwickeln, und es führt schließlich zu kumulativen Bewegungsstörungen und kognitiven Defiziten im Laufe der Zeit23.</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grants: 82071380, 81873743) unterstützt.
Materials
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
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