הזרקה דו-נקודתית מבוססת ביציבות של מודל דה-מילינציה מוקדית המושרה על-ידי ליזופוספטידילכולין בעכברים
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר הזרקה דו-נקודתית של ליזופוספטידילכולין באמצעות מסגרת סטריאוטקסית כדי ליצור מודל דמילינציה יציב וניתן לשחזור בעכברים.
Abstract
איתות ליזופוספוליפידים בתיווך קולטן תורם לפתופיזיולוגיה של מחלות נוירולוגיות מגוונות, במיוחד טרשת נפוצה (MS). ליזופוספטידילכולין (LPC) הוא ליזופוספוליפיד אנדוגני הקשור לדלקת, והוא עלול לגרום לנזק מהיר עם רעילות לשומנים של המיאלין, מה שמוביל לדה-מילינציה מוקדית. כאן, מוצג פרוטוקול מפורט להזרקת LPC סטריאוטקטית דו-נקודתית שעלולה לגרום ישירות לדה-מילינציה חמורה ולשכפל את הפגיעה הניסיונית בדה-מילינציה במהירות וביציבות בעכברים על ידי הליך כירורגי. לפיכך, מודל זה רלוונטי מאוד למחלות דמילינציה, במיוחד טרשת נפוצה, והוא יכול לתרום למחקר הרלוונטי מבחינה קלינית. כמו כן, שיטות הכתם הכחולות המהירות של לוקסול ולוקסול שימשו לתיאור מהלך הזמן של דה-מילינציה בקורפוס קלוסום של עכברים שהוזרקו להם LPC. בנוסף, השיטה ההתנהגותית שימשה להערכת התפקוד הקוגניטיבי של עכברים לאחר מודלים. באופן כללי, הזרקה דו-נקודתית של ליזופוספטידילכולין באמצעות מסגרת סטריאוטקסית היא שיטה יציבה וניתנת לשחזור ליצירת מודל דה-מילינציה בעכברים לצורך מחקר נוסף.
Introduction
איתות ליזופוספוליפידים בתיווך קולטן כולל תהליכים פיזיולוגיים מגוונים של כמעט כל מערכות האיברים1. במערכת העצבים המרכזית (CNS), איתות זה ממלא תפקיד קריטי בפתוגנים של מחלות נוירולוגיות אוטואימוניות כגון טרשת נפוצה (MS). טרשת נפוצה היא הפרעה כרונית בתיווך מערכת החיסון המאופיינת בדה-מיאלינציה פתולוגית ובתגובה דלקתית, הגורמת לתפקוד לקוי נוירולוגי ולפגיעה קוגניטיבית 2,3. לאחר הישנות מתמשכת והעברה במהלך המחלה המוקדמת, רוב החולים מתקדמים בסופו של דבר לשלב המשני-מתקדם, מה שעלול לגרום נזק בלתי הפיך למוח ולנכות 4 וכתוצאה מכך לנכות4. הוא האמין כי סימן ההיכר הפתולוגי של הקורס המשני-פרוגרסיבי הוא demyelinating פלאקים הנגרמים על ידי נגעים דלקתיים5. טיפולים קיימים בטרשת נפוצה יכולים להפחית באופן משמעותי את הסיכון להישנות המחלה. עם זאת, עדיין אין טיפול יעיל לנזקי דה-מילינליזציה ארוכי טווח הנגרמים על ידי טרשת נפוצה6 מתקדמת. לפיכך, נדרש מודל מבוסס ביציבות וניתן לשחזור בקלות כדי לחקור טיפולים פרה-קליניים המתמקדים בניוון החומר הלבן.
Demyelination ו remyelination הם שני תהליכים פתולוגיים עיקריים בפיתוח טרשת נפוצה. Demyelination הוא אובדן של נדן מיאלין סביב אקסונים המושרה על ידי מיקרוגליה עם פנוטיפים פרו דלקתיים7, וזה מוביל הולכה איטית של דחפים עצביים ומביא לאובדן נוירונים והפרעות נוירולוגיות. רמילינציה היא תגובת תיקון אנדוגנית המתווכת על ידי אוליגודנדרוציטים, שבה הפרעות עלולות להוביל לניוון עצבי ולפגיעה קוגניטיבית8. התגובה הדלקתית חיונית לכל התהליך, ומשפיעה הן על מידת הנזק למיאלין והן על התיקון.
לפיכך, מודל חייתי יציב של דה-מילינציה דלקתית מתמשכת הוא בעל משמעות להמשך חקירה של אסטרטגיות טיפוליות לטרשת נפוצה. בשל המורכבות של טרשת נפוצה, סוגים שונים של מודלים של בעלי חיים הוקמו כדי לחקות נגעים דה-מיאליננטים in vivo, כולל אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE), מודלים רעילים-דמילינה, קופריזון (CPZ) וליזופוספטידילכולין (LPC)9 . LPC הוא ליזופוספוליפיד אנדוגני הקשור לדלקת, והוא עלול לגרום לנזק מהיר עם רעילות לשומנים במיאלין, מה שמוביל לדה-מילינציה מוקדית. בהתבסס על דוחות קודמים ומחקר10,11, פרוטוקול מפורט של הזרקה דו-נקודתית עם כמה שינויים מסופק. באופן כללי, מודל ההזרקה הקלאסי של LPC בנקודה אחת מייצר רק דמילינציה מקומית באתר ההזרקה ומלווה לעתים קרובות ברמילינציה ספונטנית12,13. עם זאת, מודל ההזרקה הדו-נקודתית של LPC יכול להדגים כי ה-LPC יכול לגרום ישירות לדה-מילינציה בקורפוס קלוסום של העכבר ולגרום לדמילינציה עמידה יותר עם מעט התחדשות מיאלין.
Protocol
Representative Results
Discussion
טרשת נפוצה, מחלה כרונית של מערכת העצבים המרכזית, היא אחד הגורמים השכיחים ביותר לתפקוד נוירולוגי של מבוגרים צעירים בני20. מבחינה קלינית, כ-60%-80% מחולי הטרשת הנפוצה חווים את מעגל ההישנות וההפוגות לפני שהם מפתחים טרשת נפוצה משנית-מתקדמת21,22, ובסופו ש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענקים: 82071380, 81873743).
Materials
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
References
- Gaire, B. P., Choi, J. W. Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864 (2021).
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis – a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Mahad, D. H., Trapp, B. D., Lassmann, H. Pathological mechanisms in progressive multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 14 (2), 183-193 (2015).
- Filippi, M., et al. Multiple sclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 43 (2018).
- Villoslada, P., Steinman, L. New targets and therapeutics for neuroprotection, remyelination and repair in multiple sclerosis. Expert Opinion on Investigational Drugs. 29 (5), 443-459 (2020).
- Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936 (2018).
- Franklin, R. J., Ffrench-Constant, C. Remyelination in the CNS: From biology to therapy. Nature Reviews Neuroscience. 9 (11), 839-855 (2008).
- Gentile, A., et al. Immunomodulatory effects of exercise in experimental multiple sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2197 (2019).
- Chen, M., et al. Deficiency of microglial Hv1 channel is associated with activation of autophagic pathway and ROS production in LPC-induced demyelination mouse model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 333 (2020).
- Luo, Q., et al. A stable and easily reproducible model of focal white matter demyelination. Journal of Neuroscience Methods. 307, 230-239 (2018).
- Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination in experimental models of toxin-induced demyelination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 318, 193-212 (2008).
- Degaonkar, M. N., Raghunathan, P., Jayasundar, R., Jagannathan, N. R. Determination of relaxation characteristics during preacute stage of lysophosphatidyl choline-induced demyelinating lesion in rat brain: An animal model of multiple sclerosis. Magnetic Resonance Imaging. 23 (1), 69-73 (2005).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Plemel, J. R., et al. Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy. Glia. 66 (2), 327-347 (2018).
- Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Developmental Biology. 302 (2), 683-693 (2007).
- Kassis, H., et al. Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke. Neurochemistry International. 77, 17-23 (2014).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, 1972-1983 (2006).
- Karussis, D. The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review. Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).
- Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45 (2022).
- Kutzelnigg, A., et al. Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis. Brain. 128, 2705-2712 (2005).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality). Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).
- Lamport, A. C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum. Journal of Neuroimmunology. 334, 576995 (2019).
- Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. The cuprizone model for demyelination. Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum. 188, 72-76 (2008).
- Zhan, J., et al. The cuprizone model: Dos and do nots. Cells. 9 (4), 843 (2020).
- Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia (Barcelona, Spain). 35 (1), 32-39 (2020).
- Merkler, D., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset reflects the immunopathology of pattern II multiple sclerosis lesions. Multiple Sclerosis Journal. 12 (4), 369-374 (2006).
- Ucal, M., et al. Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats. Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).
