Summary

Une injection en deux points établie de manière stable de modèle de démyélinisation focale induite par la lysophosphatidylcholine chez la souris

Published: May 11, 2022
doi:

Summary

Le présent protocole décrit une injection en deux points de lysophosphatidylcholine via un cadre stéréotaxique pour générer un modèle de démyélinisation stable et reproductible chez la souris.

Abstract

La signalisation des lysophospholipides médiée par les récepteurs contribue à la physiopathologie de diverses maladies neurologiques, en particulier la sclérose en plaques (SEP). La lysophosphatidylcholine (LPC) est un lysophospholipide endogène associé à l’inflammation, et il pourrait induire des dommages rapides avec une toxicité pour les lipides de myéline, conduisant à la démyélinisation focale. Ici, un protocole détaillé est présenté pour l’injection stéréotaxique de LPC en deux points qui pourrait directement provoquer une démyélinisation sévère et reproduire la lésion expérimentale de démyélinisation rapidement et de manière stable chez la souris par une intervention chirurgicale. Ainsi, ce modèle est très pertinent pour les maladies de démyélinisation, en particulier la SEP, et il peut contribuer à l’avancement connexe de la recherche cliniquement pertinente. En outre, l’immunofluorescence et les méthodes de coloration bleue rapide Luxol ont été utilisées pour décrire l’évolution temporelle de la démyélinisation dans le corps calleux de souris injectées avec LPC. En outre, la méthode comportementale a été utilisée pour évaluer la fonction cognitive des souris après modélisation. Dans l’ensemble, l’injection en deux points de lysophosphatidylcholine via un cadre stéréotaxique est une méthode stable et reproductible pour générer un modèle de démyélinisation chez la souris pour une étude plus approfondie.

Introduction

La signalisation des lysophospholipides médiée par les récepteurs implique divers processus physiologiques de presque tous les systèmes d’organes1. Dans le système nerveux central (SNC), cette signalisation joue un rôle essentiel dans les pathogenies des maladies neurologiques auto-immunes telles que la sclérose en plaques (SEP). La sclérose en plaques est un trouble chronique à médiation immunitaire caractérisé par une démyélinisation pathologique et une réponse inflammatoire, provoquant un dysfonctionnement neurologique et des troubles cognitifs 2,3. Après une rechute et une rémission continues au début de la maladie, la plupart des patients finissent par passer au stade secondaire-progressif, ce qui pourrait causer des dommages irréversibles au cerveau et une invalidité résultante4. On pense que la caractéristique pathologique de l’évolution secondaire-progressive est les plaques démyélinisantes causées par des lésions inflammatoires5. Les traitements existants de la SP peuvent réduire considérablement le risque de rechute. Cependant, il n’existe toujours pas de traitement efficace pour les dommages démyélinisants à long terme causés par la SEPprogressive 6. Ainsi, un modèle stable et facilement reproductible est nécessaire pour étudier les thérapies précliniques qui se concentrent sur la dégénérescence de la substance blanche.

La démyélinisation et la remyélinisation sont deux processus pathologiques majeurs dans le développement de la sclérose en plaques. La démyélinisation est la perte de gaine de myéline autour des axones induite par la microglie avec des phénotypes pro-inflammatoires7, et elle conduit à une conduction lente de l’influx nerveux et entraîne la perte de neurones et de troubles neurologiques. La remyélinisation est une réponse de réparation endogène médiée par des oligodendrocytes, où les troubles pourraient entraîner une neurodégénérescence et des troubles cognitifs8. La réponse inflammatoire est cruciale pour l’ensemble du processus, affectant à la fois le degré de lésion de la myéline et la réparation.

Par conséquent, un modèle animal stable de démyélinisation inflammatoire persistante est utile pour explorer plus avant les stratégies thérapeutiques pour la SEP. En raison de la complexité de la SEP, divers types de modèles animaux ont été établis pour imiter les lésions démyélinisantes in vivo, y compris l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), les modèles toxiques-démyélinisants, la cuprizone (CPZ) et la lysophosphatidylcholine (LPC)9 . Le LPC est un lysophospholipide endogène associé à l’inflammation, et il pourrait induire des dommages rapides avec une toxicité pour les lipides de myéline, conduisant à la démyélinisation focale. Sur la base de rapports précédents et de recherches10,11, un protocole détaillé d’injection en deux points avec quelques modifications est fourni. Généralement, le modèle d’injection LPC classique en un point ne produit qu’une démyélinisation locale au site d’injection et s’accompagne souvent d’une remyélinisation spontanée12,13. Cependant, le modèle LPC à injection en deux points peut démontrer que le LPC peut directement induire une démyélinisation dans le corps calleux de la souris et provoquer une démyélinisation plus durable avec peu de régénération de la myéline.

Protocol

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité de l’Institut des soins aux animaux du Tongji Medical College, Université des sciences et de la technologie de Huazhong, en Chine. Des souris mâles et femelles adultes C57BL/6 (type sauvage, WT; 20-25 g; 8-10 semaines) ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été obtenues à partir de sources commerciales (voir tableau des matériaux). Les souris ont été hébergées dans une installation spécifique exempte …

Representative Results

L’injection en deux points du LPC a entraîné une démyélinisation plus durableLe LPC entraîne principalement des dommages rapides avec toxicité pour la myéline et clivage de l’intégrité de l’axone15. Le jour de l’injection était considéré comme le jour 0. Les souris ont été gardées pendant une période de 10 à 28 jours (10 dpi et 28 dpi). La coloration Luxol fast blue (LFB)10 a été utilisée pour évaluer la zone de démyélinis…

Discussion

La SEP, une maladie démyélinisante chronique du SNC, est l’une des causes les plus fréquentes de dysfonctionnement neurologique chez les jeunes adultesde 20 ans. Cliniquement, environ 60 % à 80 % des patients atteints de SEP connaissent le cycle de rechutes et de rémissions avant de développer une SEP progressive secondaire21,22, et cela conduit finalement à des troubles cumulatifs du mouvement et des déficits cognitifs au fil du…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (Subventions: 82071380, 81873743).

Materials

L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk Sigma-Aldrich L4129-25MG
32 gauge Needle HAMILTON 7762-05
10 μl syringe HAMILTON 80014
high speed skull drill strong,korea strong204
drill Hager & Meisinger, Germany  REF 500 104 001 001 005
Matrx Animal Aneathesia Ventilator MIDMARK VMR
Portable Stereotaxic Instrument for Mouse Reward 68507
Micro syringe Reward KDS LEGATO 130
Isoflurane  VETEASY
Paraformaldehyde Servicebio G1101
Phosphate buffer BOSTER PYG0021
LuxoL fast bLue Servicebio G1030-100ML
Suture FUSUNPHARMA 20152021225
Brain mold Reward 68707
Electron microscope fixative Servicebio G1102-100ML
Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain Sigma-Aldrich 1.01376
Anti-Myelin Basic Protein Antibody  Millipore #AB5864
Anti-GST-P pAb MBL #311
Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) Thermo Fisher Scientific 14-5698-95
Beta Actin Monoclonal Antibody Proteintech 66009-1-Ig 
Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody Proteintech 10458-1-AP
OLIG2 Polyclonal Antibody Proteintech 13999-1-AP
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) YEASEN 34206ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)  YEASEN 34412ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)  YEASEN 34212ES60
HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) abclonal AS014
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)  abclonal AS003
Adult C57BL/6 male and female mice Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd

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Cite This Article
Pang, X., Chen, M., Chu, Y., Tang, Y., Qin, C., Tian, D. A Stably Established Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine-Induced Focal Demyelination Model in Mice. J. Vis. Exp. (183), e64059, doi:10.3791/64059 (2022).

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