حقنة ثابتة من نقطتين لنموذج إزالة الميالين البؤري الناجم عن الليسوفوسفاتيديل كولين في الفئران
Summary
يصف هذا البروتوكول حقنة من نقطتين من الليسوفوسفاتيديل كولين عبر إطار مجسمة لتوليد نموذج إزالة الميالين مستقر وقابل للتكرار في الفئران.
Abstract
تساهم إشارات الليزوفوسفوليبيد بوساطة المستقبلات في الفيزيولوجيا المرضية للأمراض العصبية المتنوعة ، وخاصة التصلب المتعدد (MS). Lysophosphatidylcholine (LPC) هو ليسوفوسفوليبيد داخلي المنشأ مرتبط بالالتهاب ، ويمكن أن يسبب ضررا سريعا مع سمية دهون المايلين ، مما يؤدي إلى إزالة الميالين البؤري. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لحقن LPC التجسيمي المكون من نقطتين والذي يمكن أن يسبب مباشرة إزالة الميالين الشديدة ويكرر إصابة إزالة الميالين التجريبية بسرعة وثبات في الفئران عن طريق الإجراء الجراحي. وبالتالي ، فإن هذا النموذج وثيق الصلة بأمراض إزالة الميالين ، وخاصة مرض التصلب العصبي المتعدد ، ويمكن أن يساهم في الأبحاث ذات الصلة ذات الصلة ذات الصلة سريريا. أيضا ، تم استخدام طرق التلطيخ الأزرق السريع Luxol و Luxol لتصوير المسار الزمني لإزالة الميالين في الجسم الثفني للفئران التي تم حقنها باستخدام LPC. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام الطريقة السلوكية لتقييم الوظيفة الإدراكية للفئران بعد النمذجة. بشكل عام ، يعد الحقن ثنائي النقطة للليسوفوسفاتيديل كولين عبر إطار مجسمة طريقة مستقرة وقابلة للتكرار لتوليد نموذج إزالة الميالين في الفئران لمزيد من الدراسة.
Introduction
تتضمن إشارات الليزوفوسفوليبيد بوساطة المستقبلات عمليات فسيولوجية متنوعة لجميع أنظمة الأعضاء تقريبا1. في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، تلعب هذه الإشارات دورا حاسما في مسببات الأمراض العصبية المناعية الذاتية مثل التصلب المتعدد (MS). التصلب المتعدد هو اضطراب مزمن بوساطة المناعة يتميز بإزالة الميالين المرضية والاستجابة الالتهابية ، مما يسبب اختلالا وظيفيا عصبيا وضعفا إدراكيا 2,3. بعد الانتكاس المستمر والتحويل أثناء المرض المبكر ، يتقدم معظم المرضى في النهاية إلى المرحلة الثانوية التقدمية ، والتي يمكن أن تسبب ضررا لا رجعة فيه للدماغ والعجز الناتج4. ويعتقد أن السمة المميزة المرضية للمسار الثانوي التقدمي هي إزالة الميالين من اللويحات الناجمة عن الآفات الالتهابية5. يمكن أن تقلل العلاجات الحالية للتصلب المتعدد بشكل كبير من خطر الانتكاس. ومع ذلك، لا يوجد حتى الآن علاج فعال للضرر المزيل للميالين على المدى الطويل الناجم عن التصلب المتعددالتدريجي 6. وبالتالي ، هناك حاجة إلى نموذج ثابت وقابل للتكرار بسهولة لدراسة العلاجات قبل السريرية التي تركز على تنكس المادة البيضاء.
إزالة الميالين وإعادة الميالين هما عمليتان مرضيتان رئيسيتان في تطوير التصلب المتعدد. إزالة الميالين هي فقدان غمد المايلين حول المحاور العصبية التي تسببها الخلايا الدبقية الصغيرة ذات الأنماط الظاهرية المؤيدة للالتهابات7 ، وتؤدي إلى بطء توصيل النبضات العصبية وتؤدي إلى فقدان الخلايا العصبية والاضطرابات العصبية. Remyelination هي استجابة إصلاح داخلية المنشأ بوساطة الخلايا قليلة التغصن ، حيث يمكن أن تؤدي الاضطرابات إلى تنكس عصبي وضعف إدراكي8. الاستجابة الالتهابية أمر بالغ الأهمية للعملية برمتها ، مما يؤثر على كل من درجة تلف المايلين وإصلاحه.
لذلك ، فإن النموذج الحيواني المستقر لإزالة الميالين الالتهابية المستمرة له معنى لمزيد من الاستكشاف للاستراتيجيات العلاجية للتصلب المتعدد. نظرا لتعقيد مرض التصلب العصبي المتعدد ، تم إنشاء أنواع مختلفة من النماذج الحيوانية لمحاكاة الآفات المزيلة للميالين في الجسم الحي ، بما في ذلك التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي (EAE) ، ونماذج إزالة الميالين السامة ، و cuprizone (CPZ) ، و lysophosphatidylcholine (LPC)9 . LPC هو ليسوفوسفوليبيد داخلي المنشأ مرتبط بالالتهاب ، ويمكن أن يؤدي إلى تلف سريع مع سمية دهون المايلين ، مما يؤدي إلى إزالة الميالين البؤري. استنادا إلى التقارير السابقة والأبحاث10,11 ، يتم توفير بروتوكول مفصل للحقن من نقطتين مع بعض التعديلات. بشكل عام ، ينتج نموذج حقن LPC الكلاسيكي المكون من نقطة واحدة فقط إزالة الميالين المحلية في موقع الحقن وغالبا ما يكون مصحوبا بإعادة الميالين التلقائي12,13. ومع ذلك ، يمكن لنموذج LPC للحقن المكون من نقطتين أن LPC يمكن أن يحفز مباشرة إزالة الميالين في جسم الفأر الثفني ويسبب إزالة الميالين بشكل أكثر دواما مع القليل من تجديد المايلين.
Protocol
Representative Results
Discussion
مرض التصلب العصبي المتعدد، وهو مرض مزيل للميالين مزيل للجهاز العصبي المركزي، هو أحد الأسباب الأكثر شيوعا للخلل العصبي لدى الشباب20 عاما. سريريا، ما يقرب من 60٪ -80٪ من مرضى التصلب المتعدد يعانون من دورة الانتكاسات والمغفرة قبل تطوير MS الثانوي التدريجي 21,22، ويؤدي في نهاية ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنح: 82071380 ، 81873743).
Materials
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
References
- Gaire, B. P., Choi, J. W. Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864 (2021).
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis – a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Mahad, D. H., Trapp, B. D., Lassmann, H. Pathological mechanisms in progressive multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 14 (2), 183-193 (2015).
- Filippi, M., et al. Multiple sclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 43 (2018).
- Villoslada, P., Steinman, L. New targets and therapeutics for neuroprotection, remyelination and repair in multiple sclerosis. Expert Opinion on Investigational Drugs. 29 (5), 443-459 (2020).
- Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936 (2018).
- Franklin, R. J., Ffrench-Constant, C. Remyelination in the CNS: From biology to therapy. Nature Reviews Neuroscience. 9 (11), 839-855 (2008).
- Gentile, A., et al. Immunomodulatory effects of exercise in experimental multiple sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2197 (2019).
- Chen, M., et al. Deficiency of microglial Hv1 channel is associated with activation of autophagic pathway and ROS production in LPC-induced demyelination mouse model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 333 (2020).
- Luo, Q., et al. A stable and easily reproducible model of focal white matter demyelination. Journal of Neuroscience Methods. 307, 230-239 (2018).
- Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination in experimental models of toxin-induced demyelination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 318, 193-212 (2008).
- Degaonkar, M. N., Raghunathan, P., Jayasundar, R., Jagannathan, N. R. Determination of relaxation characteristics during preacute stage of lysophosphatidyl choline-induced demyelinating lesion in rat brain: An animal model of multiple sclerosis. Magnetic Resonance Imaging. 23 (1), 69-73 (2005).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Plemel, J. R., et al. Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy. Glia. 66 (2), 327-347 (2018).
- Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Developmental Biology. 302 (2), 683-693 (2007).
- Kassis, H., et al. Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke. Neurochemistry International. 77, 17-23 (2014).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, 1972-1983 (2006).
- Karussis, D. The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review. Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).
- Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45 (2022).
- Kutzelnigg, A., et al. Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis. Brain. 128, 2705-2712 (2005).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality). Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).
- Lamport, A. C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum. Journal of Neuroimmunology. 334, 576995 (2019).
- Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. The cuprizone model for demyelination. Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum. 188, 72-76 (2008).
- Zhan, J., et al. The cuprizone model: Dos and do nots. Cells. 9 (4), 843 (2020).
- Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia (Barcelona, Spain). 35 (1), 32-39 (2020).
- Merkler, D., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset reflects the immunopathology of pattern II multiple sclerosis lesions. Multiple Sclerosis Journal. 12 (4), 369-374 (2006).
- Ucal, M., et al. Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats. Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).
